[發(fā)明專利]家蠶BmSpry基因及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110378304.8
• 申請日: 2011-11-24
• 公開（公告）號: CN102392025A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設計）人: 夏慶友;蔣亮;金盛凱;程廷才;陸改;徐漢福;王根洪
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，特別是涉及家蠶的控制家蠶對核型多角體病毒（BmNPV）抗性的關(guān)鍵基因。

背景技術(shù)

蠶桑生產(chǎn)是絲綢工業(yè)的基礎(chǔ)，在我國很多農(nóng)村地區(qū)，養(yǎng)蠶業(yè)是當?shù)亟?jīng)濟的支柱性產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民的主要經(jīng)濟收入來源，蠶絲業(yè)每年為蠶農(nóng)創(chuàng)收上百億元。核型多角體病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見而且危害最嚴重的一類蠶病，引起該病的病原為核型多角體病毒（BmNPV），該病的傳染力極強并且難以控制，全國各蠶業(yè)主產(chǎn)區(qū)經(jīng)常因為該病的爆發(fā)而造成嚴重的經(jīng)濟損失。

由于BmNPV在蠶業(yè)生產(chǎn)上危害嚴重，科研工作者對它的病原特性、感染性和抵抗性作了持續(xù)深入的研究。目前的研究結(jié)果顯示：不同的家蠶品種對BmNPV的抵抗性不一樣，家蠶對BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一個是主效基因。對家蠶抗性關(guān)鍵基因及其調(diào)控序列進行克隆和鑒定，為闡明家蠶抵抗BmNPV的機制，以及培育抗性品種應用于蠶業(yè)生產(chǎn)有著重要的理論價值和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一段核苷酸序列及其制備方法，該序列為家蠶調(diào)控核型多角體病毒抗性的關(guān)鍵基因。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

家蠶BmSpry基因，所述家蠶BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ?ID?NO:1所示。

進一步，所述家蠶BmSpry基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

所述的家蠶BmSpry基因的制備方法，以家蠶大造品種全蠶或者組織cDNA為模板進行PCR擴增，設計的上游引物為?F：5'-??cggtcgtttcgttggagc-3'，設計的下游引物為R：5'-?atttgcgtagaatccaaaatactaac-3'，PCR反應條件為：94℃預變性4分鐘，然后94℃變性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，得如SEQ?ID?NO:2所示的家蠶BmSpry基因。

本發(fā)明的目的之二在于提供家蠶BmSpry基因的應用，該應用為調(diào)控家蠶核型多角體病毒抗性提供了新方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

所述的家蠶BmSpry基因在調(diào)節(jié)家蠶型多角體病毒抗性中的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：通過對轉(zhuǎn)基因家蠶敏感系統(tǒng)LI-S進行檢測，克隆得到了一個家蠶抗性關(guān)鍵基因BmSpry全長序列，包括213bp的5’非翻譯區(qū)序列（5’Untranslated?region，5’UTR）、642bp編碼區(qū)序列（Coding?sequence，CDS）和332?bp的3’非翻譯區(qū)序列（3’UTR）。BmSpry基因表達量降低一半導致家蠶對BmNPV的抵抗性降低了100倍，本發(fā)明克隆和鑒定了一個影響家蠶對BmNPV抗性的關(guān)鍵基因。BmSpry基因在培育家蠶抗BmNPV品種的理論研究和生產(chǎn)應用中都具有重要的價值。

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附圖說明

?????圖1為LI-S和正常大造添食不同濃度BmNPV以后的死亡率統(tǒng)計結(jié)果。

????圖2為LI-S外源片段在家蠶基因組和染色體上的插入位點分析。

圖3為RT-PCR檢測正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表達量。

圖4為定量PCR檢測正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表達量。

圖5為插入位點附近其他基因RT-PCR檢測結(jié)果。

圖6為BmSpry基因的結(jié)構(gòu)示意圖（上）和全長序列及對應的氨基酸序列（下）。

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具體實施方式

實施例1?轉(zhuǎn)基因家蠶LI-S和LI-A的構(gòu)建

????一?構(gòu)建轉(zhuǎn)基因增量表達載體pBac[IE1P-?lipase-1-3×P3-EGFPafm]