[發明專利]大瀧六線魚細胞系的構建方法

無效

• 申請號: 201110377593.X
• 申請日: 2011-11-24
• 公開（公告）號: CN102492650A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 李霞;郭瑩;秦艷杰;姜志強
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 曲寶威

1.一種大瀧六線魚細胞系的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

⑴、制備細胞培養液

選擇DMEM/F12培養基，向培養基內分別加入胎牛血清、人堿性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清占總體積的20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為5ng/ml,?I型胰島素樣生長因子的濃度為40ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為20ug/ml；

在4℃的環境下存放；

⑵、原代培養

在超凈工作臺上取大瀧六線魚的組織，用青霉素和鏈霉素的混合液進行浸泡處理，青霉素的濃度為100IU/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，處理時間為30分鐘；再用PBS漂洗后，剪成0.8～1.2mm³的塊狀，經上述處理的組織塊均勻接種于25cm^2?細胞培養瓶中，加入培養液3?ml，在25℃CO₂培養箱中啟動原代培養；

⑶、傳代培養

待細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，加入0.25%的胰蛋白酶溶液1ml，消化1min，細胞変圓后，吸去胰蛋白酶溶液，將之前吸出的舊培養液加回，用吸管吹打培養瓶底，制成細胞懸液；向細胞懸液內補入新的培養液，細胞懸液與培養液的體積比為1:2，然后接種于兩個培養瓶內；在25℃CO₂培養箱中培養；

待細胞再次長成單層后，仍按照上述方法進行傳代。

2.根據權利要求1所述的大瀧六線魚細胞系的構建方法，其特征在于：所述的原代培養步驟還需對塊狀組織用0.5%透明質酸酶和0.2%II型膠原酶聯合消化30min。