[發(fā)明專利]玉米低溫誘導(dǎo)型啟動子及活性分析

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110376485.0
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102399783A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘洪玉;陳宣明;張世宏;劉金亮;趙淑莉;余剛;賈承國;李桂華
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一段DNA序列，在低溫脅迫下它可以作為啟動子調(diào)控基因的表達(dá)，具體涉及一種來源于玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3并在植物中高度表達(dá)的低溫誘導(dǎo)型啟動子序列。?

背景技術(shù)

中國是一個人口眾多的農(nóng)業(yè)大國，糧食安全生產(chǎn)事關(guān)國計民生與社會穩(wěn)定。低溫傷害(包括冷害和凍害)是影響我國大部分地區(qū)的嚴(yán)重氣象災(zāi)害，尤其是東北和黃淮海地區(qū)，如東北地區(qū)在1969年、1972年和1976年發(fā)生了3次嚴(yán)重的低溫冷害，每次均使糧食減產(chǎn)50億千克以上。由于我國幅員遼闊，地形多樣，低溫冷凍害發(fā)生范圍非常廣，從亞熱帶、暖溫帶、中溫帶一直到寒溫帶都有冷凍害發(fā)生，如2008年初發(fā)生在我國南方大部分地區(qū)的雨雪冰凍及低溫冷凍災(zāi)害造成的直接經(jīng)濟損失達(dá)11億多元。目前，冷凍害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失人們還沒有太好的辦法。對于蔬菜等相對小規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，人們采用了溫室栽培，可以一定程度上抵御冷凍害對生產(chǎn)造成的損失，但溫室的建設(shè)無疑增加了生產(chǎn)成本，用過的塑料等也容易造成污染。而對于小麥等需要大面積種植的糧食作物，利用溫室栽培顯然不現(xiàn)實，人們只能根據(jù)氣象專家對氣候的預(yù)測來避開低溫時期，但由于氣候的多變性，預(yù)測的準(zhǔn)確性很低，對生產(chǎn)指導(dǎo)意義不大。因此，科學(xué)研究者只能轉(zhuǎn)而培育抗低溫的品種。?

自轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟以來，科學(xué)家們已經(jīng)得到了很多轉(zhuǎn)基因品種。然而，由于轉(zhuǎn)入的基因大多數(shù)是由組成型啟動子驅(qū)動表達(dá)的，組成型啟動子具有高效表達(dá)、且在植物整個生長期都表達(dá)的特點，這使得大部分的轉(zhuǎn)基因作物都具有植株矮小的特點，不利于植物的正常生長。而誘導(dǎo)型啟動子在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，能夠快速有效地誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，來抵御不良環(huán)境的影響。誘導(dǎo)型啟動子獨特的優(yōu)點是它能根據(jù)自身的需求在特定的組織器官、環(huán)境下誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，解決組成型啟動子面對的問題。，解決組成型啟動子面對的問題。迄今為止，從玉米中分離的逆境誘導(dǎo)型的啟動子很少。?

目前，分離和鑒定的低溫誘導(dǎo)型啟動子并不多，主要有油菜的bn115、擬南芥rd29A、cor15a和adh、小麥wes?120和玉米mlip?15等基因啟動子。其中擬南芥Columbia品種的基因組中分離得到cor15a基因的啟動子，片段大小為900bp，并構(gòu)建了與GUS基因融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入馬鈴薯，進(jìn)行GUS活性檢測。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯經(jīng)過低溫處理之后，可檢測GUS的活性，反之，則檢測不到GUS的活性，說明該啟動子受低溫誘導(dǎo)。美國康涅狄格大學(xué)的Mariya?K等構(gòu)建了cor15a基因的啟動子驅(qū)動FAD7基因的質(zhì)粒，將其整合到煙草的基因組中，使煙草獲得了抗低溫的特性。?

利用低溫誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動抗低溫基因的高效表達(dá)，從而改良作物的耐低溫性成為目前研究的熱點。然而，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動子仍然很少。因此，對于新的抗?低溫相關(guān)啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動子研究的重點。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種低溫誘導(dǎo)型啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)，而且該啟動子來源于玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3。?

本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的低溫誘導(dǎo)型啟動子真核表達(dá)載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目的基因ZmDBP3的低溫誘導(dǎo)型啟動子序列和5’非翻譯區(qū)。?

本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米成熟胚，該轉(zhuǎn)基因玉米胚能反映啟動子誘導(dǎo)活性的高低。?

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的低溫誘導(dǎo)型啟動子區(qū)，并構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的載體，所述載體包含帶有ZmDBP3基因的5’非翻譯區(qū)的上述啟動子。隨后利用所述載體在玉米成熟胚中誘導(dǎo)表達(dá)，并觀察到該啟動子與低溫誘導(dǎo)相關(guān)的高水平活性。?

本發(fā)明提供一種獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動子序列，包含相對于SEQ?ID?NO：1的轉(zhuǎn)錄起始位點的-1bp至-1151bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，低溫可以在植物中誘導(dǎo)本發(fā)明所述的啟動子的高水平活性。?

獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動子序列源自玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3。?