[發明專利]山羊痘病毒和綿羊痘病毒雙重PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201110375782.3
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102367492A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 李應國;聶福平;肖雯;楊俊;肖進文;王國民;李賢良;王昱
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;李應國
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

1.?山羊痘病毒和綿羊痘病毒雙重PCR檢測試劑盒，其特征是：它包括Mix?PCR反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中：

所述Mix?PCR反應液管由以下反應液組成：

序列為SEQ?ID?NO1的10?mmol/L的上游引物0.5?μL；

序列為SEQ?ID?NO2的10?mmol/L的下游引物0.5?μL；

序列為SEQ?ID?NO3的10?mmol/L的上游引物0.5?μL；

序列為SEQ?ID?NO4的10?mmol/L的下游引物0.5?μL；

10×PCR?buffer?緩沖液2.5?μL；

25?mmol/L?MgCl₂?2?μL；

10?mmol/L?dNTP?1?μL；

5U/μL?Taq?DNA聚合酶0.3?μL；

滅菌水14.2?μL；

合計22?μL，為單次反應的用量；

所述陽性對照管：管內為山羊痘病毒和綿羊痘病毒各自的重組質粒，比例為1:1，2μL～20μL，其DNA序列如下：

山羊痘病毒重組質粒pMD19-T-G的DNA序列為SEQ?ID?NO5；

綿羊痘病毒重組質粒pMD19-T-S的DNA序列為SEQ?ID?NO6；

所述陰性對照管：管內為無羊痘病毒感染的山羊肌肉組織DNA樣品，2μL～20μL；

所述滅菌去離子水管：1～2mL。

2.權利要求1?所述試劑盒，其特征是：山羊痘病毒和綿羊痘病毒在同一PCR反應體系中進行特異性擴增，根據擴增片段的大小，將山羊痘病毒和綿羊痘病毒鑒別與區分。

3.權利要求1所述試劑盒用于的山羊痘病毒和綿羊痘病毒雙重PCR檢測方法，步驟如下：

(1)制備待測樣品核酸模板

取?100μL～200μL或100mg～200mg待檢樣品，用商品化核酸提取試劑盒或實驗室常規使用的提取病毒核酸的方法提取待檢樣品中的基因組DNA，即為待測樣品核酸模板；

(2)PCR擴增檢測：取3μL待測樣品核酸模板和陰性對照管或3μL待測樣品核酸模板陽性對照管，分別用Mix?PCR反應液管進行PCR擴增；

PCR擴增條件是：

預變性：95?℃?5?分鐘；

循環：94?℃變性30秒，53?℃退火30秒，72℃延伸30?秒，35個循環；

延伸：72?℃?5分鐘；

（3）結果判定：在222bp和177bp位置有兩條擴增條帶，分別為山羊痘病毒和綿羊痘病毒特異性擴增條帶，表示山羊痘病毒和綿羊痘病毒呈陽性；在這兩處位置無可見擴增帶，表示山羊痘病毒和綿羊痘病毒呈陰性。