[發明專利]用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法

無效

• 申請號: 201110375776.8
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN103131753A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 樊景鳳;郭建麗;付慧;陳佳瑩;韓彥壘;袁秀堂
• 申請（專利權）人: 國家海洋環境監測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/02
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所 11216
• 代理人: 劉激揚

1.一種用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，該方法包括：

微生物生物量碳測定方法，在該測定方法中，從生物修復海區和對照海區取得沉積物樣本，于干燥器中進行熏蒸處理；轉移熏蒸樣品至聚乙烯塑料瓶中，于震蕩機上震蕩浸提，中速定量濾紙過濾，吸取少量濾液于消煮管中，加入重鉻酸鉀-硫酸溶液和濃鹽酸處理后瓷片混勻，消煮爐中煮沸冷卻后轉移至三角瓶中，滴定，計算；

微生物基礎呼吸測定方法，在該測定方法中，從生物修復海區和對照海區取得沉積物樣本，均勻平鋪于培養瓶底部，將盛有一定量氫氧化鈉溶液的吸收瓶置于其中密封培養，取出吸收瓶內堿液，滴定，計算；

微生物纖維素分解作用測定方法，在該測定方法中，將白布剪成布條置于H₂SO₄溶液中煮沸除凈淀粉，取出布條洗去多余H₂SO₄，于烘箱內烘至恒重稱重，分別從生物修復海區和對照海區取得沉積物樣本平鋪于培養皿中，將烘至恒重的布條平鋪其上再將等量沉積物覆蓋其上，培養，計算；

細菌總數的測定方法，在該測定方法中，分別稱取生物修復海區和對照海區沉積物樣本，于試管內用滅菌陳海水梯度稀釋，取稀釋樣品置培養基上涂勻，培養，計數；

硝化與反硝化細菌MPN-PCR計數方法，在該測定方法中，采用傳統的苯酚-氯仿抽提法對沉積物樣品的細菌總DNA進行粗提，采用寶生物公司的DNA凝膠回收試劑盒對總DNA進行純化，將此DNA進行逐級稀釋，以稀釋后DNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，查MPN表，計數；

微生物多樣性分析方法，在該測定方法中，采用傳統的苯酚-氯仿抽提法對沉積物樣品的細菌總DNA進行粗提，采用寶生物公司的DNA凝膠回收試劑盒對總DNA進行純化，用特定引物進行巢式PCR反應，反應產物再進行V3區段擴增，擴增結果進行瓊脂糖電泳檢測后直接用于DGGE，采用分析軟件計算電泳條帶灰度值，計算香濃-威爾指數H。

2.根據權利要求1所述的用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，其中在微生物生物量碳測定步驟的樣品前處理部分，關閉干燥器的閥門后，在25℃的黑暗條件下放置24h，打開閥門，如果沒有空氣流動的聲音，表示干燥器漏氣，應重新稱樣進行熏蒸處理。

3.根據權利要求1所述的用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，其中在微生物纖維素分解作用測定步驟中，將布條置于0.1％H₂SO₄溶液中煮沸，直至布條與碘液不成藍色反應為止，此時表明布條上淀粉已被除凈。

4.根據權利要求1所述的用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，其中在硝化與反硝化細菌MPN-PCR計數步驟中，氨氧化細菌PCR擴增引物序列為：

CTO189f：5′-GGAGRAAAGCAGGGGATCG-3′

CTO654r：5′-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3′。

5.根據權利要求1所述的用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，其中在硝化與反硝化細菌MPN-PCR計數步驟中，亞硝酸鹽氧化細菌PCR擴增引物序列為：

5-′TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′

5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。

6.根據權利要求1所述的用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，其中在硝化與反硝化細菌MPN-PCR計數步驟中，反硝化細菌PCR擴增引物序列為：

nirS1F：5′-CCTA(C/T)TGGCCGCC(A/G)CA(A/G)T-3′

nirS6R：5′-CGTTGAACTT(A/G)CCGGT-3′。

7.根據權利要求1所述的用多個微生物學指標對生物修復海區進行評價的方法，其中在微生物多樣性分析步驟中，合成細菌16S?rDNA的引物序列為：

27F：5′-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3′

1492R：5′-TACggTTACCTTgTTACgATCC-3′

合成細菌16S?rDNA基因V3區段的引物序列為：

F341：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′

R518：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。