[發(fā)明專利]鵝原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110375632.2
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN103131666A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓春春;王繼文;潘志雄;劉賀賀;李亮;許峰;許恒勇;康波;魏守海;何樺
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.鵝原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，其操作步驟是：

(1)將禁食11～13h的鵝腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量是28～31mg/kg體重和肝素鈉95～105IU/kg體重，待其麻醉，仰臥位固定，腹部被皮消毒；

(2)沿鵝腹部正中線切開腹腔，快速取出完整的肝臟，用38～40℃生理鹽水把肝臟表面洗干凈；

(3)洗凈的肝用38～40℃前灌流液灌流直至肝變?yōu)榈S色；

(4)再換成38～40℃清洗液沖洗出肝中前灌流液；

(5)然后再用溫度為38～40℃的0.04～0.06％酶灌流液反復(fù)灌流，直至肝被膜下組織呈龜背狀裂隙；

(6)把肝臟放入一玻璃培養(yǎng)皿中，撕開被膜，將肝臟剪碎；

(7)將剪碎的肝組織和膠原酶液一起倒入一無菌錐形瓶中，38～40℃水浴繼續(xù)消化5～10min左右；

(8)加入含9～12％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止其消化；

(9)然后用200目無菌紗網(wǎng)進行過濾，除去大的細胞團，獲得肝細胞懸液；

(10)以900～1000r/min，38～40℃離心肝細胞懸液1.8～2.2min，棄上清，在沉淀中加入PBS，再次制成肝細胞懸液；

重復(fù)步驟(10)三次，直至肝細胞懸液清亮；

(11)然后往肝細胞懸液中加入含9～12％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并把細胞吹打均勻；

(12)用血細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)后，用DMEM培養(yǎng)液稀釋到3～5×10⁵個cell/ml的密度，接種到細胞培養(yǎng)皿中，于4～6％CO₂、38～40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使之貼壁；

(13)肝細胞培養(yǎng)2.8～3.2h后，用PBS清洗2～4次，以去掉未貼壁的血細胞和細胞碎片，獲得活的原代肝細胞；

(14)然后，加入9～12％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于4～6％CO₂、38～40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.如權(quán)利要求1所述鵝原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，上述步驟中所述的前灌流液制作步驟是：在500ml去離子水中依次加入8g?NaCl，0.078g?NaH₂PO₄2H₂O，0.4g?KCl，0.151gNa₂HPO₄2H₂O，0.35g?NaHCO₃，0.19g?EDTA，2.38g?HEPES，溶解后用1M?NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.4，用去離子水定容至1L，高溫高壓滅菌30min。

3.如權(quán)利要求1所述鵝原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，上述步驟中所述的清洗液是：在500ml去離子水中依次加入8gNaCl，0.078g?NaH₂PO₄2H₂O，0.4g?KCl，0.051g?Na₂HPO₄2H₂O，0.35g?NaHCO₃，0.14g?CaCl₂，2.38g?HEPES，溶解后用1M?NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.4，用去離子水定容至1L，高溫高壓滅菌30min。

4.如權(quán)利要求1所述鵝原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，上述步驟中所述的酶灌流液是：在50ml超純水中依次加入8gNaCl，0.078g?NaH₂PO₄2H₂O，0.4g?KCl，0.051g?Na₂HPO₄2H₂O，0.35g?NaHCO₃，0.56g?CaCl₂，2.142g?HEPES，30mg膠原酶，溶解后用1M?NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.4，用去離子水定容至100ml，用0.22μm濾膜過濾除菌。