[發明專利]一種蜂毒的精制方法

有效

• 申請號: 201110375594.0
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102526116A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 程文顯;畢焰華;花家元;王友軍
• 申請（專利權）人: 程文顯
• 主分類號: A61K35/64
• 分類號: A61K35/64;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 吳啟運

一、技術領域

本發明涉及一種蜂毒的分離純化方法，具體地說是一種蜂毒的精制方法。

二、背景技術

蜂毒是工蜂腺體分泌出來的一種具有芳香氣味的毒液，儲存于毒囊中，當工蜂攻擊其它物種時由尾部蟄針排出，它是一種復雜的混合物，其化學組成復雜，主要分為多肽，大分子量的酶類，小分子量的胺類等物質，肽類主要包括蜂毒素(約占蜂毒干重的50％)，蜂毒明肽，MCD肽，心臟肽，安度肽，組胺肽等，酶類包括55種以上的酶類物質，其中磷脂酶A₂(簡稱PLA₂，平均分子量14500)是受蜂蜇之后產生過敏反應的主要物質，胺類包括組織胺、兒茶酚胺等其它活性胺類物質，胺類與受蜂蜇產生疼痛有關。

蜂毒在民間用于醫療保健歷史悠久，現代研究證實，蜂毒具有抗炎和鎮痛作用，用于治療風濕性關節炎、類風濕性關節炎，強直性脊椎炎等風濕性疾病，周圍神經炎肌神經痛等疾病有確切的療效，然而蜂毒中大分子量的酶類物質容易造成過敏，小分子量的胺類物質容易造成疼痛，極大地影響了蜂毒制劑在臨床上的推廣使用。

CN101088514A公開了一種蜂毒的精制方法，是將粗蜂毒溶于乙醇溶液中去除蜂毒中的蜂膠、蜂蜜等雜質，再采用溶媒萃取方法，得到精制蜂毒。先將粗蜂毒加入95％乙醇制成懸濁液，過濾去除雜質，濾液離心后去除液相，沉淀物加入無水乙醇脫水，再將提出的沉淀物加入水于10±2℃下浸提12-15HR；浸提液用乙醇沉淀，去除乙醇水溶液，沉淀物加入0.15-0.2摩爾的氫氧化銨與正丁醇溶液中萃取，棄除沉淀物，蒸餾萃取液，濃縮物進行冷凍干燥即得到精制蜂毒。

CN1416827A公開了一種蜂毒的提取方法。該發明所述的方法如下：將活體大胡蜂剪去羽翅置于有密封蓋的容器內，加入40％以上濃度的乙醇水溶液或者40℃以上的食用酒，使活體大胡蜂完全浸泡于其中，將容器加蓋密封，靜置至少3天，取其容器內下部的乳白色液體，過濾。

CN101455287A公開了一種蜂毒肽的分離提純方法，是將粗蜂毒用水浸洗，濾液用乙醇沉淀，沉淀物用氫氧化銨和正丁醇萃取，萃取液以丙酮沉淀，使沉淀物溶于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換柱上作洗脫層析，柱下收集溶血活性最強吸收峰V的層析餾分濃縮，濃縮液經葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，丙酮沉淀，再溶解、脫鹽沉淀處理，沉淀物溶于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上以緩沖B液作梯度洗脫，柱下收集吸收峰時層析餾分濃縮、脫鹽冷凍干燥即得到電泳級蜂毒肽。

CN1088215A公開了一種快速從粗蜂毒中分離蜂肽的方法，將粗蜂毒溶解在蒸餾水中，使用超濾膜和透析袋對蜂毒進行分離、純化。

三、發明內容

本發明旨在提供臨床注射用的精制蜂毒，所要解決的技術問題是盡可能多地除去蜂毒中的酶和生物胺類。

本精制方法包括蜂毒粗品的制備和蜂毒粗品的純化，具體步驟如下：

1、溶解：取蜂毒加5-10倍重量的去離子水溶解后高速離心(3000rpm)10-15分鐘，傾出上清液，包括棕灰色殘渣內的殘留物再加去離子水溶解、高速離心后過濾分離，合并水相，備用。高速離心的作用是使油脂狀雜質與殘渣分離，轉移并漂浮在水相的表面。

2、沉淀：向上述水相中加入1-3倍體積的丙酮，于溫度≤-8℃條件下靜置至沉淀完全(實驗表明不少于10小時)，傾出上清液，向沉淀物中再加入丙酮并搗碎，過濾分離，沉淀物揮去丙酮便得到蜂毒粗品。

實驗表明，要使以蜂毒素為主的肽類沉淀完全(≥99％)，丙酮與水溶液的體積比要≥1，取1∶1為佳，這樣可節省丙酮用量。

3、純化：用濃度0.08-0.12mol/L醋酸溶液溶解蜂毒粗品，上葡聚糖凝膠G50層析柱，以0.08-0.12mol/L醋酸溶液洗脫，并用UV-3000紫外檢測器在280nm波長下進行在線檢測，當第三峰出現時開始收集，至第三峰下降到100mV停止收集。向洗脫液中加入活性炭，緩慢攪拌0.5-1小時，過濾分離，濾液冷凍干燥，得精制蜂毒。

實驗表明葡聚糖凝膠G50可有效去除大分子量的PLA2和HAase(透明質酸酶，分子量45000)等酶類蛋白質，又可去除小分子量的胺類物質。活性炭的作用不僅是脫色，同時可有效去除內毒素，活性炭的加入量為洗脫液質量的0.02-0.05％。

蜂毒中大分子量物質約占蜂毒干重的16％左右，通過柱色譜分離，大分子量物質含量＜1.5％，蜂毒素含量≥76％(粗品中蜂毒素含量45％左右)，本精制蜂毒可直接加工供臨床注射用的凍干制劑。

四、附圖說明

圖1是柱層析時紫外在線檢測圖譜。