[發(fā)明專利]三倍體高甜苷羅漢果培育技術(shù)

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110375226.6
• 申請(qǐng)日: 2011-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN102812902A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉敬梅;夏勉;游覽;謝瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計(jì)前沿實(shí)驗(yàn)室(北京)有限公司
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00;A01H5/08;C12N5/04
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明結(jié)合植物組織培養(yǎng)、多倍體誘導(dǎo)和遺傳育種雜交技術(shù)，培育獲得三倍體高甜苷羅漢果，屬現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

羅漢果果實(shí)性涼味甘，有清熱潤肺、涼血、潤腸通便的功效，特別是其中羅漢果甜苷V甜度約為蔗糖的300倍，是肥胖病人、糖尿病病人、高血壓病人理想的食品添加劑，它集天然甜味劑與保健品于一體，被國際公認(rèn)為綜合性狀最佳的天然甜味劑。羅漢果被認(rèn)為是一種非常有潛力的甜味植物品種。長期以來，由于羅漢果落后栽培技術(shù)，病毒病害嚴(yán)重，品種退化，導(dǎo)致羅漢果資源稀缺。近十年，經(jīng)過脫毒技術(shù)，羅漢果組培繁殖快速發(fā)展起來，但發(fā)現(xiàn)組培苗果實(shí)中籽粒多且大，不含甜苷成分的種子占整果的50%，整果利用率低，果實(shí)種子內(nèi)的油脂使提取液渾濁，增加了提取難度和成本，二倍體羅漢果甜苷的提取僅在1%左右。品種缺陷造成提取得率低的問題很難通過改進(jìn)提取工藝來得到解決，使得甜苷價(jià)格昂貴，僅能在高端產(chǎn)品中使用。這一問題制約了羅漢果種植業(yè)及其加工業(yè)的發(fā)展。?

采用現(xiàn)代生物技術(shù)培育羅漢果苷含量高、果實(shí)結(jié)籽減少或無籽優(yōu)良羅漢果品種，對(duì)羅漢果產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。通過人工誘導(dǎo)多倍體是現(xiàn)代育種工作的一個(gè)重要手段。植物多倍體中含有較多的染色體組數(shù)，往往在體型上表現(xiàn)出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍體植物在品質(zhì)和生物量上，都較二倍體優(yōu)越。特別是植物三倍體具有不結(jié)籽的特性，是解決羅漢果多籽缺陷的最有效途徑。?

中國專利申請(qǐng)CN101120653B公開了無籽羅漢果及其培育方法,?通過1）取二倍體羅漢果雌、雄株外植體繁育組培苗；2）取組培繼代苗，進(jìn)行染色體加倍的誘導(dǎo)；3）切取經(jīng)誘導(dǎo)處理后的雌、雄株的不同部位進(jìn)行分化培養(yǎng)；4）切取分化培養(yǎng)成的新芽莖尖和莖段進(jìn)行叢生芽培養(yǎng)；5）將培養(yǎng)成的完整植株進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)，篩選出四倍體植株進(jìn)行生根培養(yǎng)、煉苗；6）將四倍體植株和二倍體植株按常規(guī)技術(shù)種植，開花時(shí)進(jìn)行人工授粉雜交，得到雜交種子；7)將雜交種子繁殖成完整植株，進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)；篩選出三倍?體植株，生根培養(yǎng)、煉苗；8)將三倍體植株和二倍體植株種植，開花時(shí)用?二倍體雄株對(duì)三倍體的雌株人工授粉，雌株掛果后得到無籽羅漢果。?

本發(fā)明人通過長期研究發(fā)現(xiàn)，上述技術(shù)存在獲得的四倍體和三倍體的不穩(wěn)定問題，（能否進(jìn)一步說明一下其不穩(wěn)定的表現(xiàn)），并且在其技術(shù)流程中經(jīng)秋水仙素處理，結(jié)合叢生芽誘導(dǎo)，獲得四倍體的周期長，嵌合率高，重復(fù)性差，影響了該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明采用幼胚獲得脫毒組培苗，嫩芽莖尖直接在秋水仙素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)染色體加倍，結(jié)合流式細(xì)胞重復(fù)鑒定分析，獲得穩(wěn)定四倍體，進(jìn)而與二倍體雜交獲得穩(wěn)定三倍體，大大縮短了四倍體誘導(dǎo)周期，使該項(xiàng)技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用成為可能，本技術(shù)將通過大幅提高甜苷含量和整果利用率，迅速解決甜苷價(jià)格昂貴的瓶頸問題，促進(jìn)羅漢果甜苷售價(jià)大幅降低和廣泛應(yīng)用于飲料、食品、保健品、藥品等行業(yè)（取代有副作用的其他甜味劑），經(jīng)濟(jì)效益可觀。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種適用于三倍體高甜苷羅漢果培育的生產(chǎn)技術(shù)。?

本發(fā)明三倍體高甜苷羅漢果的培育方法，具體步驟如下：?

1、取田間表型好的羅漢果鮮果，在超凈臺(tái)中進(jìn)行整果消毒：先用75%乙醇消毒5-8分鐘，再用20%次氯酸鈉消毒15-20分鐘，最后無菌水沖洗3-5次。

2、消毒完畢的整果在超凈臺(tái)中破殼，取出羅漢果種籽，于培養(yǎng)皿中剝出種仁，并將種仁放置于MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)出芽。?

3、待芽長至15-20天左右，切取2-3片嫩葉提取DNA，RFLP分析進(jìn)行雌雄株鑒定。鑒定為雌株（見附圖1）的株系切取嫩芽莖尖，?0.2%秋水仙素誘導(dǎo)48-52小時(shí)，誘導(dǎo)后于MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。?

CTAB法提取羅漢果基因組DNA方法如下：?

A.?1//2、1/3片葉在液氮中研成粉末（或用打樣機(jī)）；

B.?將樣品放入液氮凍過的EP管中，加65℃預(yù)熱2×CTAB?1ml；

C.?65℃水浴1h；

D.?加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提，離心10000rpm，10min，取上清；

E.加入等體積異丙醇，-20℃沉淀20-30min；

F.10000rpm離心10min，倒掉上清，70%乙醇，10000rpm，10min，倒掉上清，晾干；

G.加30-50ul?dd?H₂O水溶解，-20℃保存;

RFLP分析PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20ul）如下：

水???????????13.2ul