[發明專利]玉米干旱誘導型蛋白基因啟動子及活性分析

無效

• 申請號: 201110373866.3
• 申請日: 2011-11-22
• 公開（公告）號: CN102533759A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 潘洪玉;胡瑞學;張世宏;劉金亮;賈承國;李桂
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00;C12N15/11
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術領域

本發明屬生物工程技術領域，具體涉及玉米干旱誘導型蛋白基因(LOC100135422)啟動子克隆。?

背景技術

干旱生態危機已嚴重影響到人類的可持續發展，因此在農業生產中，急需耐旱、水分脅迫環境下生長良好的糧食作物和植被。隨著現代基因工程技術的迅速發展，植物耐旱已從傳統的植物生理研究轉向分子方面的研究。作物分子育種技術的采用，使得以基因水平替代原先的染色體組水平進而精細地調節育種成為可能。?

高等植物基因的表達調控已成為分子生物學研究領域的熱點，啟動子是基因表達調控的重要元件，深入研究啟動子的結構和功能，建立可用于植物轉基因表達的時、空、量三維調控系統，可為功能基因組學研究及通過基因工程技術精確地調節植物代謝提供全新的思路。?

選擇適宜的啟動子驅動目的基因在轉基因植物中表達，已成為植物基因工程研究的熱點問題之一。針對不同的目的基因，人們選用不同的啟動子，從而使靶基因在特定組織或條件下選擇性表達，以利于轉基因植物的正常生長發育(趙恢武等，2000；劉強等，2000)。對植物在干旱逆境下大量表達的耐旱基因啟動子研究表明，不同耐旱基因的啟動子往往含有相同的順式作用元件，并受相同的反式作用因子的調控。這為我們提供了另外一條研究植物耐旱機制的途徑。?

國內外科學家利用一些耐旱相關的特異性啟動子(如RD29A)、特異性蛋白(如脫水素)、耐旱相關的特異性酶(如TPS)基因進行植物遺傳轉化并獲得了成功，得到一些耐旱品質明顯提高的轉基因植株。清華大學的劉強等(2002)將來自擬南芥的干旱誘導型基因RD29A的兩個轉錄調控因子轉入擬南芥后發現擬南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世慶(2006)通過基因槍介導轉化小麥幼胚愈傷組織，經過分子生物學檢測及在PEG脅迫下的GUS組織化學染色證實了RD29A啟動子在小麥愈傷組織中能夠誘導GUS基因的表達。也有科研工作者直接利用干旱誘導型啟動子啟動某些耐旱有關的蛋白表達進行植物耐旱機理的研究。如：利用特異性的啟動子啟動與耐旱有關的基因(如：脫水素基因等)或特異性的滲透調節物合成酶基因在煙草、擬南芥等模式植物體內表達獲得耐旱植株；通常情況下在雙子葉植物中常用的組成型啟動子CaM35S啟動海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在煙草和擬南芥中均獲得耐旱植株，而用誘導型啟動子RD29啟動TSP(海藻糖-6-磷酸合酶)在煙草中表達，獲得了較為明顯的耐旱煙草植株。單子葉植物的Ubiquitin-promoter由兩部分組成：exon和intron，其中intron具有增強子的功能。目的基因在其啟動下能夠大量穩定的在單子葉植物體內表達。浙江大學郝中娜等(2005)對水稻OsWRKY19及OsWRKY89基因的啟動子進行功能研究，表明這兩個基因的啟動子是組織特異性表達的誘導型啟動子。Brown等(2010)首次發現冬小麥blt101基?因啟動子內存在高度保守的TCA-like元件與誘導目的基因在低溫脅迫下高效表達密切相關。Takumi(2003)等分離了小麥低溫應答基因家族基因Wcor15上游的啟動子序列證實該啟動子受低溫和光誘導。?

利用干旱誘導型啟動子驅動抗旱基因的高效表達，從而改良作物的耐旱性成為目前研究的熱點。然而，目前能應用于轉基因研究的誘導型啟動子仍然很少。因此，對于新的抗旱相關啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉錄因子的研究仍然是今后啟動子研究的重點。?

發明內容

本發明的一個目的是提供一種干旱誘導型啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導目標基因高水平表達，而且該啟動子來源于玉米早期干旱誘導蛋白基因LOC100135422(以下簡稱LOC)。?

本發明的第二個目的是提供一種用于植物轉化的干旱誘導型蛋白基因LOC啟動子載體，該載體指導高水平表達目標基因LOC的干旱誘導型蛋白基因LOC啟動子序列和5′非翻譯區。?

本發明的第三個目的是提供一種所述載體轉化的轉基因植物。該轉基因植物能反映啟動子誘導活性的高低。?

本發明的第四個目的是提供玉米早期干旱誘導型蛋白基因LOC啟動子的核心序列。?

為實現上述目的，本發明克隆了玉米早期干旱誘導型蛋白基因LOC的干旱誘導型啟動子區，并構建了用于植物轉化的載體，所述載體包含帶有干旱誘導型基因LOC的5′非翻譯區的上述啟動子。隨后利用所述載體在玉米胚中誘導表達，并觀察到該啟動子與干旱誘導性相關的高水平活性。并用煙草葉盤轉化的方法得到轉基因煙草，對轉基因煙草通過GUS染色發現，該啟動子具有干旱誘導的特性，并通過熒光定量的方法初步確定了該啟動子的核心區域。?