[發明專利]豬O型口蹄疫重組噬菌體疫苗及其構建方法

無效

• 申請號: 201110373860.6
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102416174A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 徐海;王義偉;侯繼波
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: A61K39/135
• 分類號: A61K39/135;A61P31/14;C12N7/01;C12N15/63;C12R1/92
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明涉及T7噬菌體展示豬O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位的重組噬菌體構建及應用，屬于分子生物技術領域。

背景技術

口蹄疫(FMD)是偶蹄動物的一種急性、烈性傳染病，嚴重威脅動物及其產品的國內外貿易乃至于人類的健康。FMD一旦暴發，隨之而來所采取的封鎖、隔離、撲殺牲畜等強制措施將給發病國家或地區帶來重大的經濟損失。因此，FMD一直被世界動物衛生組織(OIE)列在A?類傳染病之首?？谔阋叩牟≡瓰榭谔阋卟《?，是小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬成員。病毒粒子為二十面體，無囊膜，直徑20～30nm，結構比較簡單，完整的病毒顆粒包括衣殼和RNA兩部分，病毒的RNA為單股正鏈RNA，全長8.5kb。

O型FMDV至少有5個中和性抗原位點。位點1由VP1的G-H環和C?端氨基酸殘基的線性表位組成，從病毒中分離的VP1可以誘導動物產生相應中和性抗體，該位點是FMDV最重要的抗原位點，也是FMDV抗原變異關鍵所在。位點2位于病毒表面VP2的B-C環和E-F環上，在三重軸附近，由4個表位組成。位點3位于病毒表面五重軸周圍VP1的B-C環。位點4位于五重軸周圍VP3的B-B“結節”上。位點5位于VP1的G-H環內，與位點1是相互獨立的。它們在功能上都是獨立的，但是在單拓撲結構上很可能有重疊。抗體競爭試驗表明，位點1、2和3在拓撲結構上是獨立的，位點2和4在拓撲結構上是關聯的。

研究表明，結構蛋白VP1～VP4均參與抗原位點的形成，但發揮主要作用的是VP1，該基因位于FMDV基因組的2977～3615位核苷酸，編碼213個氨基酸。結構蛋白VP1功能區內包含FMDV的主要抗原位點，能誘導感染動物產生中和性抗體，其中第140～160位氨基酸處的G-H環是主要的保護性抗原位點,有連續的B細胞表位，具有較大的運動性,在其頂部形成了一個高度保守的Arg-Gly-Asp?(RGD)序列，是FMDV的細胞受體位點。其次，在C端200～213位氨基酸殘基有T細胞抗原表位。

T7噬菌體是感染大腸桿菌的小型烈性噬菌體，基因組為線狀雙鏈DNA，長39?936bp。其衣殼蛋白包括主要頭蛋白(P10A)、次要頭蛋白(P10B)、頸圈蛋白(P8)、尾蛋白(P11、P12)和尾絲蛋白(P17)，其中P10A和P10B是由p10編碼的是一對重疊蛋白，P10A有344個氨基酸殘基，P10B有397個氨基酸殘基，是在P10A的phe341處翻譯移碼產生的，在野生型T7噬菌體中，P10B約占衣殼蛋白總量(415拷貝)的10%。對T7噬菌體的生物學特性，己經做過全面深入地研究，基因組全部序列己經測定。與入噬菌體和絲狀噬菌體相比，T7噬菌體更易培養且繁殖更快，37℃下3h形成噬菌斑，感染后1-2h完全裂解。

T7噬菌體展示系統是一種新型的展示系統，對p10進行了改造，自然狀態下的翻譯移碼位點被去除，并在348位氨基酸之后重組入了一個多克隆位點，使得基因組中僅表達改造后的P10B?(415拷貝)，因而可以將外源肽段以融合蛋白的形式展示在P10B上。T7噬菌體展示系統具有操作簡便、復制周期短、容易培養、生長迅速、系統穩定、勿需分泌到周質或膜外而是直接展示，

重組噬菌體疫苗具有以下優勢：噬菌體作為表達產物的載體展示的是生物體自身翻譯機制產生的天然構象產物，能很好的誘發機體的抗原-抗體免疫反應；噬菌體有較強的免疫原性，在噬菌體表面表達的多肽易于接近抗體，容易被免疫系統識別；噬菌體可以募集T輔助細胞，而且噬菌體顆粒的不對稱性有利于引發T細胞依賴的免疫反應；由于噬菌體顆粒是由感染的細菌分泌，噬菌體顆?？梢苑奖愕拇笠幠Ｉa疫苗用抗原表位，還可以在同一噬菌體上展示多個具有保護性作用的抗原決定簇，構建多價疫苗；噬菌體生長迅速，純化簡單、花費少；噬菌體顆粒穩定，對理化因素的抵抗力強。

發明內容

本發明的目的是克服現有多肽疫苗技術的不足之處，提供一種高效的豬O型口蹄疫重組噬菌體疫苗。

本發明的豬O型口蹄疫重組噬菌體疫苗，以重組T7噬菌體為抗原，所說的重組T7噬菌體表面表達有氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的Mya98譜系FMDV?VP1(129-169)位多肽，所說的多肽由VP1(129-169)基因插入T7噬菌體P10B基因下游融合表達獲得。

所述的Mya98譜系FMDV?VP1(129-169)位多肽基因選自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列；