[發明專利]A型禽流感重組噬菌體疫苗及其構建方法

有效

• 申請號: 201110373859.3
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102397540A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 徐海;王義偉;侯繼波
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61K39/12;A61P31/16
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

1.A型禽流感重組噬菌體疫苗，其特征在于，以重組T7噬菌體為抗原，所說的重組T7噬菌體表面表達有氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的H5亞型A禽流感病毒M2蛋白膜外區23肽，即M2e肽，所說的H5亞型禽流感病毒是比對NCBI發表的H5亞型禽流感病毒基因序列后選取的優勢流行毒株，所說的M2e基因由兩拷貝的優勢流行毒株的M2e基因插入T7噬菌體P10B基因下游表達獲得。

2.根據權利要求1所述的A型禽流感重組噬菌體疫苗，其特征在于，所述的兩拷貝的M2e基因選自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列；

2)具有SEQ?ID?NO：1所示序列經增加或減少拷貝數的核苷酸序列；

2)具有SEQ?ID?NO：1所示序列經改變、缺失或增加一個或幾個核苷酸但仍表達具有M2e主要抗原活性多肽的核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的A型禽流感重組噬菌體疫苗，其特征在于，所說的疫苗中還包含用于乳化重組T7噬菌體的白油佐劑。

4.權利要求1-3中任意一種A型禽流感重組噬菌體疫苗的構建方法，其特征在于，包括下列步驟：

A、構建重組噬菌體

(1)合成一段DNA序列，該DNA序列克隆至pUC-19載體多克隆位點中，DNA序列的5’端有酶切位點EcoRⅠ，3’端含有酶切位點HindⅢ，其DNA序列如SEQ?ID?NO：3所示；

(2)用限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ將上述DNA序列從pUC-19載體上切下后插入T7噬菌體多克隆位點的EcoRⅠ和HindⅢ之間，構建重組噬菌體；

(3)用T7噬菌體包裝蛋白組裝重組噬菌體，包裝產物通過瓊脂糖夾心法擴增，用PCR方法篩選陽性重組噬菌體，重組噬菌體展示兩拷貝的M2e，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

B、重組噬菌體的制備

????甘油凍存的E.coli?BL21菌株在LB體培養基平面上劃線接種，37℃過夜培養；從平皿上挑取單菌落，接種5mL?LB培養液，37℃、200轉/分震蕩培養過夜，取3mL過夜培養物接種300mL?LB培養液，培養至OD₆₀₀=0.8左右，挑取平皿上的單個噬菌斑，接種到培養好的BL21宿主菌中，37℃、100轉/分震蕩培養2-3小時，直至菌液由渾濁變為澄清，用PEG沉淀的方法回收噬菌體，并按常規的方法測定噬菌體滴度，將回收的噬菌體調整濃度為2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100轉/分震蕩滅活過夜；

C、制備重組噬菌體油乳劑疫苗。

5.根據權利要求4所述的A型禽流感重組噬菌體疫苗的構建方法，其特征在于，所述的重組T7噬菌體的載體為T7?Select?415-1b。