[發明專利]一種尿液中多胺類物質的測定方法

無效

• 申請號: 201110373076.5
• 申請日: 2011-11-22
• 公開（公告）號: CN102495148A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 畢開順;李清;劉然;賈英;尹然
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種尿液中多胺類物質的測定方法，更確切地說是一種對尿液中多胺類物質進行高效靈敏定量測定的方法。?

背景技術

多胺是一類小分子脂肪胺類化合物，帶有兩個或兩個以上伯胺基與仲胺基，通常指1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺及其酰化產物等。多胺在生物體內廣泛存在，參與基因表達和翻譯的調節、細胞增殖等生命活動過程，與癌癥的發生發展密切相關。?

目前對體內內源性物質多胺的定量測定主要有液相色譜-熒光衍生化法、液相色譜-紫外衍生化法、免疫法和液相色譜-質譜檢測法幾種。液相色譜-熒光衍生化法具有靈敏的特點，但其它內源性物質易干擾其測定，專一性較差難以滿足高水平臨床研究的需要；液相色譜-紫外衍生化法具有專一的特點，但靈敏度又很難適合體內低濃度的多胺測定；免疫法雖操作相對簡便，但對各多胺分離能力差，測定交叉干擾嚴重，且實施價格較高，對臨床后續研究性價值不高。液相色譜-質譜聯用技術具有專一性強、靈敏度高的優點，在體內藥物分析、內源性物質測定分析和代謝組學相關領域方面已有成熟的應用，是近年來應用迅速發展的分析測試技術。

由于多胺是小分子化合物，具有結構簡單、在體內含量低的特點，而臨床檢測需建立快速、靈敏、準確、經濟的測定方法，因此實際能夠應用在臨床上的多胺檢測方法目前尚未完全建立。?

發明內容

本文目的是采用簡便的預處理方法、靈敏的檢測手段，建立尿液中多胺的分析方法，實現尿液中痕量多胺的檢測，使多胺在癌癥的預診、治療評價以及在抗癌藥物的開發研究中發揮重要作用。?

本發明所述多胺類物質優選1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、酰化精胺、精脒、精胺。?

本發明是這樣實現的：?

（1）尿液樣本預處理：

a．取一定量采集的尿液，加入一定量內標溶液及一定量高氯酸，渦旋混勻后，離心取上清液；

b．取經a步驟處理后的上清液，加入衍生化試劑、堿化試劑，渦旋混勻，在超聲條件下反應后加入中止反應試劑、萃取溶劑后震蕩，上層有機溶液轉移吹干，加入甲醇超聲離心后取上清液，進行LC?-MS分析。

（2）?液相分離：?

a．采用C₁₈作固定相，

b．流動相A：甲醇，流動相B：水。

????梯度洗脫并控制流速?

（3）??MS?測定：

電噴霧離子源，正離子掃描。

步驟（1）a操作中，內標溶液優選物質量濃度為500ng/ml的1,6-已二胺，高氯酸的質量濃度優選5%-9%。?

步驟（1）b操作中，衍生化試劑、堿化試劑的加入順序優選先加入堿化試劑，后加入衍生化試劑。?

步驟（1）b操作中，堿化試劑優選0.5?mol/L至2?mol/L氫氧化鈉溶液。?

步驟（1）b操作中，衍生化試劑為苯甲酰氯溶液和乙腈的混合溶液，苯甲酰氯質量濃度優選1%-5%。?

步驟（1）b操作中，超聲反應時的溫度優選30^oC。?

步驟（1）b操作中，中止反應試劑優選飽和氯化鈉溶液。?

步驟（1）b操作中，萃取溶劑優選乙醚。?

步驟（2）中梯度洗脫優選14分鐘內甲醇體積濃度由55?%上升到74?%，控制流速優選在0.8?ml/min-1.2?ml/min，柱溫優選20?^oC-40^?oC，進樣體積優選10?μL-25?μL。?

步驟（3）中，質譜條件優選毛細管電壓：4200-4500?V，霧化氣流速:?1.1-1.3?Bar，干燥氣流速:?5.0-7.0?L???min^-1，干燥氣溫度:?210-230?^oC，掃描范圍:?50-900?m/z，定量離子:?1,3-丙二胺?m/z:?303.1，腐胺?m/z:?319.1，尸胺?m/z:?333.2，酰化精胺m/z:?579.3，1,6-已二胺(內標)m/z:?347.2，精脒?m/z:?480.2，精胺?m/z:?641.3。?