[發明專利]七個抑制BMPR-1B基因表達合成的shRNA分子

有效

• 申請號: 201110372522.0
• 申請日: 2011-11-22
• 公開（公告）號: CN102433337A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 黃俊成;林嘉鵬;金賢華;汪立芹;白杰;劉晨曦
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種科學研究中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術領域

?本發明涉及能夠對骨形成蛋白受體-1B(BMPR-1B)基因產生顯著抑制作用的小干擾RNA分子的設計、合成和抑制作用在卵母細胞上的評價方法。

背景技術

BMPR-1B基因是一種增加排卵率的調控基因，屬于TGF-?超家族成員，又稱為ALK6基因；ALK6?突變是在Booroola母羊(FecB)中發現的第一個點突變，發生在高度保守的胞內激酶區，核苷酸830處（A830G），引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R)；其顯性表現型為卵泡發育提前以及產多胎。文獻檢索披露：(1)Biol.Reprod.64,1225-1235作者：Wilson,T.等發表《表現為多胎性狀的Booroola羊，在卵母細胞和顆粒細胞表達的ALK6基因的一個突變》文章內容是攜帶Fec^B純合子的母羊其排卵率升高，伴隨著大量囊狀卵泡比Fec^B+雜合子的母羊提前成熟并發生排卵；因此，攜帶Fec^B純合子母羊其排卵前卵泡提前達到了最大直徑并維持在一定水平，直到排卵，導致最終卵泡生長動力學發生了變化。(2)ReproductiveBiologyandEndocrinology2006,4:20doi:1184/1477-7827-4-20作者Stéphane?Fabre等發表《在哺乳動物中調節排卵率：羊基因模型的作用》文章，內容是BMP15,GDF9,BMPR-1B這三個基因型來理解BMP系統的作用作為卵巢內濾泡生長和成熟的調節最后影響排卵率。(3)Reproduction?(2011)?141?643-651作者Wei?Wang等發表《RNA分子干擾豬的含有內源性SMAD4的顆粒細胞導致的FSH介導的顆粒細胞的增值和類固醇合成的減少》文章內容是在豬的顆粒細胞上用RNA干擾的方法敲低了SMAD4，結果顯示了SMAD4-siRNA抑制了SMAD4的mRNA和蛋白的表達并抑制了FSH引起的豬顆粒細胞的分化和雌二醇的分泌和細胞周期蛋白的表達。

關于BMPR-1B基因shRNA分子的研究，ALK6?基因干擾的小鼠并沒有像Booroola母羊一樣表現出多胎性狀，且卵泡發育和排卵率都表現正常，但其軟骨形成受到影響，骨骼肌發育存在缺陷,說明ALK6?突變存在種屬差異,針對其它家畜品種，如綿羊、山羊、豬等，均未見報道。

本發明構思根據綿羊BMPR-1B基因cDNA序列，自行設計合成的shRNA分子，通過功能驗證，從設計的shRNA分子庫中，篩選到7個對綿羊BMPR-1B基因均有顯著抑制作用的shRNA分子，為綿羊生物學研究拓展了應用領域。

發明內容

本發明的目在于：通過對照組細胞BMPR-1B表達水平，從8種shRNA分子中篩選到7個具有顯著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可達90%以上，而對BMPR-1B蛋白的抑制可達80%以上。

?本發明的目的是這樣實現的：根據GeneBank?中綿羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；從啟始密碼（ATG）至終止密碼（TGA）共1515bp編碼區序列，用shRNA設計軟件設計干擾BMPR-1B基因轉錄的shRNA分子群,從設計的34條shRNA分子中，根據結構和位置篩選出8條針對不同位點的shRNA序列進行合成；將合成的兩條互補單鏈的shRNA分子經退火形成雙鏈后，分別連接到pLL3.7慢病毒干擾載體上,構建了8個慢病毒干擾RNA質粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），干擾RNA質粒與BMPR-1B表達載體經脂質體轉染293T法產毒，攜帶BMPR-1B的病毒穩定感染Hek293細胞系，然后攜帶干擾RNA病毒感染攜帶BMPR-1B的Hek293細胞系，通過實時定量熒光PCR及Western?blot從mRNA及蛋白水平分析了BMPR-1B的表達，以及shRNA對BMPR-1B的干擾抑制作用，通過分析和比較實驗組與對照組細胞BMPR-1B表達水平，從8個shRNA分子中篩選到7個具有顯著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可達90%以上，而對BMPR-1B蛋白的抑制可達80%以上，最終確定的7個顯著抑制BMPR-1B基因表達的shRNA分子；

其中使用的引物：

①LV-BMPR-1B-749??