[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法及其專用地衣芽胞桿菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110369152.5
• 申請(qǐng)日: 2011-11-18
• 公開（公告）號(hào): CN102391970A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬翠卿;李理想;張麗杰;許平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P7/18;C12R1/10
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法及其專用地衣芽胞桿菌。?

背景技術(shù)

2，3-丁二醇廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航天航空等多個(gè)領(lǐng)域(Appl?Microbiol?Biotechnol，2001，55(1)：10-18)。因其熱值較高(27,200kJ/kg)，同乙醇(29,100kJ/kg)相當(dāng)，可用作燃料添加劑；可代替1，4-丁二醇，用于聚酯和聚亞安酯的合成；其脫水產(chǎn)物甲乙酮是一種低沸點(diǎn)溶劑，廣泛應(yīng)用于涂料、潤滑劑、燃料等行業(yè)，同時(shí)又可作為有機(jī)合成香料、抗氧化劑等的中間體；其脫水產(chǎn)物1，3-丁二烯可用來合成橡膠單體，是一種重要的石油化工基礎(chǔ)有機(jī)原料；同甲乙酮縮合加氫形成辛烷，可用于生產(chǎn)高級(jí)航空用油。?

目前2，3-丁二醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)法主要以石油裂解時(shí)產(chǎn)生的丁烯為原料，經(jīng)過HClO的氧化及NaOH的作用后，在高溫高壓下水解得到幾種不同種類的丁二醇，再通過減壓分餾分離獲得。相比于化學(xué)法，微生物發(fā)酵法具有環(huán)境友好，工藝簡單等特點(diǎn)。自然界中具有2，3-丁二醇生產(chǎn)能力的細(xì)菌主要包括，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽胞桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)等(J?Biotechnol，1993，27(3)：317-329)。目前，國內(nèi)外發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的研究常用菌株多為克雷伯氏菌，但其潛在的致病性，限制了克雷伯氏菌在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。芽胞桿菌具有生物安全性，現(xiàn)已有多粘芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌生產(chǎn)2，3-丁二醇的報(bào)道(CN201010026807.1，CN101851598A，World?J.Microbial.Biotechnol.，8，378-381)，但其發(fā)酵液濃度較低或發(fā)酵周期較長，限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。同時(shí)，已報(bào)道的2，3-丁二醇生產(chǎn)菌株發(fā)酵溫度均為30～42℃，需要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，造成了能源的浪費(fèi)和營養(yǎng)的損失。?

嗜熱的芽胞桿菌由于其具有較高的發(fā)酵溫度(42～60℃)，大大減少了發(fā)酵過程中污染雜菌的機(jī)會(huì)。同時(shí)，以較高的溫度進(jìn)行發(fā)酵，可降低發(fā)酵液粘度，有利于后續(xù)處理步驟的操作，而且可以在培養(yǎng)基不滅菌的條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，降低了能耗和2，3-丁二醇的生產(chǎn)成本。?

經(jīng)檢索，未見利用嗜熱的地衣芽胞桿菌生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有2，3-丁二醇生產(chǎn)方法中的技術(shù)難點(diǎn)及存在問題，本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法及其專用嗜熱地衣芽胞桿菌。?

本發(fā)明所述嗜熱地衣芽胞桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)5-2-D，其已于2011年11月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，湖北省武漢市武昌珞珈山)，保藏號(hào)為：CCTCC?M?2011371。?

上述地衣芽胞桿菌(Bacillus?licheniformis)5-2-D?CCTCC?M?2011371菌株形態(tài)為棒桿狀，長1.5μm～3.0μm，直徑0.6μm～0.7μm，菌落顏色為黃色或白色，產(chǎn)芽孢，VP反應(yīng)成陽性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖產(chǎn)酸，可水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可利用檸檬酸鹽，可在含100g/L?NaCl的培養(yǎng)基中生長，可在42～60℃條件下生長。?

上述地衣芽胞桿菌CCTCC?M?2011371菌株的脂肪酸圖譜是典型的芽孢桿菌的脂肪酸圖譜。?

上述地衣芽胞桿菌CCTCC?M?2011371菌株的16S?rDNA序列(SEQ?ID?NO.1所示)與其他已知不同種的地衣芽孢桿菌的16S?rDNA序列有99％～100％的相似性。?

上述地衣芽胞桿菌CCTCC?M?2011371菌株可以在高糖(糖150克/升)LB培養(yǎng)基中生長。?

本發(fā)明所述生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法是：以42～55℃、培攪拌養(yǎng)18～60小時(shí)為發(fā)酵條件，以葡萄糖為底物發(fā)酵上述地衣芽孢桿菌CCTCC?M?2011371，得到2，3-丁二醇。?

具體步驟順是：?

(1)斜面培養(yǎng)：將地衣芽孢桿菌CCTCC?M?2011371菌種接種于含有1.5～2wt％的瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為42～55℃，培養(yǎng)時(shí)間為8～12小時(shí)；?

(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)的斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下接種到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為42～55℃，培養(yǎng)方式為旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間8～12小時(shí)；?