[發(fā)明專利]一種DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)方法及其重組載體和基因工程菌

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110368962.9
• 申請日: 2011-11-18
• 公開（公告）號: CN102505023A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 花強(qiáng);韋柳靜;馬娜;范宇翔;劉念念;周燕;張婕;李婷蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N9/10;C12Q1/48;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種在大腸桿菌中異源表達(dá)可溶性的由珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma?pretiosun)aroF基因編碼的DAHP合酶的方法及其重組載體和基因工程菌。

背景技術(shù)

美登素(Maytansinoid)是1972年首先從衛(wèi)矛科植物美登木(Maytenus?hookeri?Loes)中分離得到的抗癌化合物。安莎霉素(Ansamitocin)是珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema?pretiosum)來源的美登素衍生物，多達(dá)二十幾種，臨床藥理實驗表明該類化合物具有治療白血病和肺癌的作用。

安莎霉素是在起始單位3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)和延伸單位2-甲氧基丙二酰ACP(2-methoxymalonyl-ACP)作用下通過一系列的鏈起始、延伸和終止合成碳骨架，再經(jīng)過一系列的后修飾合成安莎霉素。安莎類化合物的生理活性非常強(qiáng)，目前人們正在努力將它們開發(fā)為臨床上有用的抗癌藥物，例如將美登素或其衍生物與以腫瘤細(xì)胞為靶點的抗生素結(jié)合制成導(dǎo)彈藥物。莽草酸途徑是合成芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的重要途徑，它的起始物質(zhì)為戊糖代謝的中間產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷酸(erythose4-phosphate，E4P)和糖酵解過程的一個中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，二者在DAHP合酶的作用下縮合形成一個七碳酮糖開鏈磷酸化合物，稱為3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，即DAHP，再經(jīng)脫磷酸環(huán)化，形成苯環(huán)后通過脫水、加氫形成莽草酸(shikimate)。在可以產(chǎn)生利福平素B的菌株Amycolatopsis?mediterranei?S66中發(fā)現(xiàn)了另一種特殊的莽草酸途徑即：氨基莽草酸途徑(aminoshikimate?pathway)，它在其早期階段與莽草酸生物合成途徑平行，在合成代謝過程中有氨基摻入，并在氨基DAHP合酶的作用下形成AHBA。

目前，在已經(jīng)公布的珍貴橙色束絲放線菌(A.pretiosum)的安莎合成基因簇的基因中尚未發(fā)現(xiàn)氨基DAHP合酶(amino-DAHP合酶)的基因，因此，莽草酸途徑和氨基莽草酸途徑的第一分歧DAHP合酶和氨基DAHP合酶的差異是否存在值得質(zhì)疑。另外，一些有趣的問題例如DAHP合酶是否同時發(fā)揮著氨基DAHP合酶的作用以及amino-DAHP中的氨基基團(tuán)是怎樣引入的等都值得我們進(jìn)一步深入探討。DAHP合酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用有許多問題尚待解決。DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)是解決這些問題的關(guān)鍵一環(huán)，但是目前還未能實現(xiàn)DAHP合酶的異源可溶性表達(dá)，不能大量獲得具有酶活性的DAHP合酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對目前某些外源基因如珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynenma?pretiosun)aroF基因編碼的DAHP合酶無法實現(xiàn)異源可溶性表達(dá)的現(xiàn)狀，提供一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)的方法及其所用的重組載體和表達(dá)菌株以及重組蛋白的純化和檢測方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：一種外源基因在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)的方法，包括以下步驟，構(gòu)建表達(dá)重組外源蛋白的表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體與表達(dá)分子伴侶GroEL/GroES的載體共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中從而獲得可溶性表達(dá)外源蛋白的大腸桿菌基因表達(dá)工程菌，進(jìn)行共表達(dá)。

本發(fā)明中，所述的外源蛋白是常規(guī)蛋白，優(yōu)選來自珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema?pretiosum)的DAHP合酶。所述的DAHP合酶優(yōu)選氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。所述的外源蛋白的編碼基因可以是常規(guī)，優(yōu)選來自珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema?pretiosum)中編碼DAHP合酶的aroF基因。所述的aroF基因優(yōu)選核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述的珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema?pretiosum)是常規(guī)，優(yōu)選珍貴橙色束絲放線菌(A.pretiosum)ATCC?31565。

本發(fā)明中，所述的表達(dá)分子伴侶GroEL/GroES的載體是常規(guī)，只要能夠在大腸桿菌中表達(dá)分子伴侶GroEL和GroES即可，優(yōu)選pGro7質(zhì)粒。

本發(fā)明中，所述的大腸桿菌表達(dá)菌株是常規(guī)的大腸桿菌表達(dá)菌株，優(yōu)選E.coli?BL21(DE3)。