[發明專利]一種油菜種皮中不同來源ANS基因表達的快速檢測方法及運用

有效

• 申請號: 201110368487.5
• 申請日: 2011-11-20
• 公開（公告）號: CN102433379A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 嚴明理;劉麗莉;舒佳賓
• 申請（專利權）人: 湖南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 張家界市慧誠商標專利事務所 43209
• 代理人: 高紅旺

技術領域

本發明涉及生物技術及分子育種領域，特別是利用核苷酸多態性和等位特異PCR技術檢測油菜種子中來自A染色體組、B染色體組和C染色體組的ANS基因表達的方法。

背景技術

油菜是世界上重要的油料作物。油菜育種的主要目標之一是在雙低的基礎上選育黃籽油菜品種。在相同的遺傳背景下，黃籽油菜與黑籽油菜相比具有種皮薄、含油量高、木質素含量低等優點。無論是黃籽油菜還是黑籽油菜種子的胚都是黃色的，黃籽的種皮是透明的，黑籽的種皮為黑色，黃籽的顏色是其胚顏色的體現，油菜種子表現出來的顏色差別是由種皮決定的。?

研究表明油菜中種皮顏色的深淺和透明度取決于花色素合成酶(ANS)活性高低，而花色素合成酶活性的強弱直接由ANS基因的表達量控制。現有檢測ANS基因的表達的方法為特異引物RT-PCR和Northern分析方法，但這些方法不能區分表達的ANS基因是來自A染色體組、B染色體組還是C染色體組，其中白菜(Brassica?campestris,?AA,?2n=20)為A染色體組；黑芥(Brassica?nigra，BB,?2n=16)?為B染色體組；甘藍(Brassica?oleracea,?CC,?2n=18)?為C染色體組。由于以往的油菜3個基本種(白菜、黑芥、甘藍)和3個異源四倍體(芥菜型油菜，甘藍型油菜，埃塞俄比亞芥)的ANS基因的序列信息不完善，使RT-PCR和Northern分析方法不能區分表達的ANS基因是來自A染色體組、B染色體組還是來自C染色體組，無法在育種過程中用于大規模使用。為了進一步研究油菜種皮顏色形成的分子調控機理，加快黃籽油菜品種選育的進程，非常需要有一種能有效區分表達的ANS基因是來自A染色體組、B染色體組還是C染色體組的檢測方法。

?發明內容

本發明的目的是提供一種能快速、簡便、有效區分油菜種皮中表達的ANS基因來源的檢測方法。

本發明的技術方案，包括如下步驟：

?（1）根據油菜三個基本種(白菜、甘藍、黑芥)和三個異源四倍體(芥菜型油菜、甘藍型油菜、埃塞俄比亞芥)ANS基因的序列比對分析，尋找核苷酸多態性位點；白菜(Brassica?campestris,?AA,?2n=20)為A染色體組；黑芥(Brassica?nigra，BB,?2n=16)?為B染色體組；甘藍(Brassica?oleracea,?CC,?2n=18)?為C染色體組；

（2）通過比較A、B、C染色體組中ANS基因的多態性，利用引物設計軟件分別設計A、B、C染色體組的特異引物；通過PCR條件的優化，確定特異擴增A、B、C染色體組ANS基因的引物；

所述特異擴增A染色體組ANS基因的引物為：

上游引物5'-TTAGCGAAAAGCGGGATCAGC-3'，

下游引物5'-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3',?該引物對只能使來自A染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為296bp；

所述特異擴增B染色體組ANS基因的引物為：

上游引物?5'-TTAGCAAAGAGCGGAATCGAA-3'，

下游引物5'-CCACGGGCAAACCGAAGAA-3'，該引物對只能使來自B染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為296bp;?

所述特異擴增C染色體組ANS基因的引物為：

上游引物?5'-TAGCAATGGGAAGTTTAAGAGTA-3'，

下游引物5'-GTGGTTCATAGAGCATATCTCG-3'，該引物對只能使來自C染色體組的ANS基因有擴增產物，PCR產物大小為452bp；

（3）從不同類型油菜授粉后10-30天的種皮中分離總RNA，分別反轉錄后，進行特異引物PCR擴增；

（4）PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠為染料，電泳后用凝膠分析系統進行分析，根據引物特異性與電泳帶的有無，確定表達的ANS基因是來自哪個染色體組；

如果來自A染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為290bp，說明表達的ANS基因是來自A染色體組;

如果來自B染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為290bp，說明表達的ANS基因是來自B染色體組;

如果來自C染色體組ANS基因的特異引物擴增，電泳分離的擴增片段大小約為450bp，說明表達的ANS基因是來自C染色體組。