[發(fā)明專利]藍(lán)莓提取物用于預(yù)防阿爾茨海默病

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110367516.6
• 申請(qǐng)日: 2011-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102641351A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張艷波;劉靜怡;童瑤;施祖榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張艷波
• 主分類號(hào): A61K36/73
• 分類號(hào): A61K36/73;A61P25/28
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 蔣常雪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域。具體涉及藍(lán)莓提取物對(duì)β-淀粉樣蛋白及同型半胱氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。?

背景技術(shù)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s?Disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病。主要的臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，并伴隨各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。在我國(guó)65歲以上的老年人中患病率約為5％。AD的主要病理特征之一是在大腦皮層和海馬出現(xiàn)由β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚積形成的老年斑(SP)。大量研究已經(jīng)表明，Aβ在AD的病中起著相當(dāng)重要的作用。Aβ的神經(jīng)毒性能引起氧化應(yīng)激，線粒體損傷，激活凋亡因子，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，臨床研究證明血漿中同型半胱氨酸水平增高可增加AD的發(fā)病率。因此，減少Aβ的生成，抑制Aβ或同型半胱氨酸引起的神經(jīng)損傷是研究AD治療的熱點(diǎn)之一。?

目前治療AD的藥物主要是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥、擬膽堿藥或膽堿酯酶抑制劑，均屬對(duì)證治療藥物，不能減緩AD病情的發(fā)展。藍(lán)莓(Vaccinium?myrtillus?L.)制劑現(xiàn)已廣泛用于各種保健品，可預(yù)防眼科及心血管方面的疾病。然而藍(lán)莓提取物對(duì)AD的預(yù)防作用還未見(jiàn)報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為藍(lán)莓物用于預(yù)防海默病提供細(xì)胞水平的依據(jù)。發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)含25％總花青素的藍(lán)莓提取物可有效對(duì)抗Aβ_25-35及同型半胱氨酸引起的細(xì)胞毒性，抵制細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3的表過(guò)。該藥理作用在本發(fā)明以前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。?

附圖說(shuō)明

圖1，和對(duì)照組比較，經(jīng)Aβ_25-35處理后細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡特征：表現(xiàn)為細(xì)?胞核變小或破碎，熒光增強(qiáng)。藍(lán)莓提取物預(yù)處理可有效抑制Aβ_25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。藍(lán)莓提取物對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響(A：對(duì)照組，B：Aβ_25-35處理組，C：25μM藍(lán)莓提取物預(yù)處理組，D：50μM藍(lán)莓提取物預(yù)處理組)?

圖2，和對(duì)照組比較Aβ_25-35處理后PC12細(xì)胞caspase-3的表達(dá)顯著增高。藍(lán)莓提取物預(yù)處理可有效降低caspase-3的表達(dá)。?

藍(lán)莓提取物抑制Aβ_25-35誘導(dǎo)的caspase-3表達(dá)增高。?

具體實(shí)施方式

細(xì)胞培養(yǎng)：PC12細(xì)胞于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含8％胎牛血清，8％馬血清的DMEM培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×10⁴/100μl接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24h。?

藥物處理：藍(lán)莓提取物由香港東方保健品公司提供。細(xì)胞加入終濃度為0-50μM的藍(lán)莓提取物，培養(yǎng)24h以觀察藍(lán)莓提取物的細(xì)胞毒性。細(xì)胞先不同濃度的藍(lán)莓提取物預(yù)處理1h，再加入0.5μM?Aβ_25-35或5mM同型半胱氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h以觀察藍(lán)莓提取物對(duì)Aβ25-35及同型半胱氨酸毒性的對(duì)抗作用。?

MTT細(xì)胞活力測(cè)定：藥物處理后，去除培養(yǎng)液，每孔加入50μlMTT溶液(終濃度0.5mg/ml)，37℃培養(yǎng)4h后，每孔加入50μlMTT裂解液(20％SDS，50％DMFpH4.7)，37℃反應(yīng)過(guò)夜。酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞570nm的OD值。將OD值轉(zhuǎn)換為百分比(％)。未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞OD值設(shè)為100％。每組6空對(duì)照，結(jié)果用?表示。?

熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將生產(chǎn)良好的PC12細(xì)胞接種于6孔板，37℃孵育24h。分組及藥物處理同上。棄除培養(yǎng)液，用4％多聚甲醛于4℃固定30min。用磷酸緩沖液(0.1M?PBS，pH7.4)漂洗后，加入終濃度為5μg/ml的Hochest33258避光染色10min，PBS漂洗后封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凋亡。?

Western?blot檢測(cè)caspase-3的表達(dá)?

方法：將生長(zhǎng)良好的PC12細(xì)胞接種于6孔板，37℃孵育24h。分組及?藥物處理同上。用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5％脫脂牛奶的TBST緩沖液(含0.05％Tween20的TBS緩沖液)室溫封閉1h。將膜與溶解于TBST緩沖液的caspase-3一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌5min×3次后，將膜與溶解于TBST緩沖液的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h。TBST洗滌5min×3次，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。?

附圖1說(shuō)明：?