[發(fā)明專利]Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2及其編碼基因與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110366059.9
• 申請(qǐng)日: 2011-11-17
• 公開（公告）號(hào): CN102492026A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳三鳳;高淼;陶麗;王磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/195
• 分類號(hào): C07K14/195;C12N15/31;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/84;A01H5/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)

由于全球氣候變暖，世界人口不斷增加，工業(yè)污染加劇，灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，化肥使用不當(dāng)?shù)纫蛩?，土壤鹽漬化日趨嚴(yán)重，這不僅使得土壤荒漠化、生態(tài)環(huán)境進(jìn)一步惡化，并且已經(jīng)成為阻礙作物生長(zhǎng)發(fā)育及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要因素。目前，解決問題的主要途徑還是傳統(tǒng)改良鹽漬土的方法，如淡水洗滌、合理灌溉和使用CaCO₃等。但是，傳統(tǒng)措施投資大、效益低，并且隨著大量化學(xué)物質(zhì)的加入會(huì)加劇土壤的次生鹽漬化，這迫使人們考慮采用其它措施來(lái)改良利用鹽漬土壤。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，培育抗鹽漬、耐干旱的適宜在鹽漬土壤上生長(zhǎng)并具有較高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的植物品系，是開發(fā)利用鹽漬土壤的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。所以對(duì)耐鹽基因的研究成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

在自然界中存在著大面積自然形成或者人工形成的各種各樣的鹽堿環(huán)境，如海洋、鹽(堿)湖、鹽場(chǎng)、鹽堿地以及腌制品等為一般生物生長(zhǎng)和存活的極限，但卻生長(zhǎng)著能適應(yīng)這種極端環(huán)境的微生物，我們把這類微生物稱為耐鹽微生物或嗜鹽微生物。根據(jù)細(xì)菌對(duì)NaCl的需求和最適生長(zhǎng)需要的NaCl濃度，可將細(xì)菌分為四類：(1)非嗜鹽菌：生長(zhǎng)不需要NaCl，低濃度的NaCl(＜1％)就會(huì)對(duì)它們的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用；(2)輕度嗜鹽菌：生長(zhǎng)需要少量的NaCl，其最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為1～3％；(3)中度嗜鹽菌：生長(zhǎng)離不開NaCl，它們可在0.1～32.5％的條件下生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為3～15％；(4)極端嗜鹽菌：一般在9％NaCl以上生長(zhǎng)，可在9～35％濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為13～15％。其中中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌屬于極端環(huán)境微生物。中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌大多存在于海洋、鹽(堿)湖、鹽場(chǎng)、沙漠植物、鹽堿地和鹽漬食物等高鹽環(huán)境中。

嗜鹽或耐鹽微生物在鹽域環(huán)境中，一方面細(xì)胞通過(guò)積累親和性溶質(zhì)，例如糖、多元醇、氨基酸和氨基酸衍生物等，積累過(guò)程既可以通過(guò)自身合成也可以通過(guò)環(huán)境攝入；另一方面細(xì)胞將多余的Na⁺排除細(xì)胞外，以維持胞內(nèi)較低的鹽濃度，從而維持細(xì)胞正常的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能。Na⁺輸出系統(tǒng)又稱為鈉離子(或單價(jià)陽(yáng)離子)/氫離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或簡(jiǎn)稱為Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na⁺/H⁺antiporter)，廣泛存在于微生物(包括細(xì)菌和真菌)、植物和動(dòng)物細(xì)胞中。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于跨膜蛋白，催化單價(jià)陽(yáng)離子(如Na⁺、K⁺、Li⁺)輸出，該過(guò)程與質(zhì)子(H⁺)的輸入相偶聯(lián)。嗜鹽或耐鹽微生物將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Na+再排到細(xì)胞外，主要就是通過(guò)次級(jí)Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)的。目前研究的單亞基逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要有NhaA、NhaB、NhaC、NhaD、NhaE、NhaG、NhaP、ChaA和MdfA等。

大腸桿菌有4個(gè)不同的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分別是NhaA、NhaB、ChaA和MdfA。ChaA除能輸出Na⁺交換H⁺外，還能輸出Ca⁺與H⁺交換，NhaA(簡(jiǎn)稱Ec-NhaA)是大腸桿菌適應(yīng)在高濃度Na⁺、L⁺及堿性pH下生長(zhǎng)所必需的主要逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。NhaB賦予大腸桿菌一定的耐鹽性，但在NhaA缺失條件下，NhaB在維持細(xì)菌生長(zhǎng)方面起著重要作用。nhaA和nhaB雙缺失突變后，大腸桿菌變成鹽敏感突變株，在含0.2M?NaCl培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，該突變株(nhaA^-和nhaB^-)被廣泛用于通過(guò)功能互補(bǔ)的基因克隆中。

在嗜鹽微生物中，中度嗜鹽菌是一個(gè)對(duì)鹽濃度耐受范圍最廣的類群，在自然界分布廣泛，具有獨(dú)特的基因類型、特殊的生理機(jī)制、多樣化的代謝產(chǎn)物和潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此大量獲取其基因資源，得到更好、更多的轉(zhuǎn)基因材料具有重要的研究意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種中度嗜鹽菌Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2及其編碼基因。