[發(fā)明專利]用于藏獒精子保存的冷凍液

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110365716.8
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102379279A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張大宇
• 申請（專利權(quán)）人: 張大宇
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于藏獒精子保存的冷凍液，用于藏獒精液的冷凍及人工授精。?

背景技術(shù)

藏獒主要飼養(yǎng)繁育在中國青藏高原牧區(qū),?藏獒長期受高海拔、低氣溫、低氧量的生態(tài)環(huán)境影響，具備體型高大，性格剛毅兇猛等特點，深受我國甚至世界藏獒愛好者的稱贊。近20年來，藏獒文化、經(jīng)濟得到了快速的發(fā)展，藏獒養(yǎng)殖已使牧民形成了致富的產(chǎn)業(yè)，給牧民帶來了數(shù)以千萬經(jīng)濟收入。由于管理粗放,沒有進行專門的選育改良,再加上環(huán)境的變遷和優(yōu)良種群的流失,藏獒本身的繁殖力和繁殖成活率低等因素,使藏獒處于瀕臨滅絕的境地。

學者們對藏獒精液冷凍技術(shù)進行了較深入研究,通過人工授精以改良藏獒,提高藏獒的繁殖率。然而藏獒精液品質(zhì)對藏獒改良及提高繁殖率是至關(guān)重要的一環(huán),研究發(fā)現(xiàn)好多內(nèi)在和外在的因素都會影響藏獒精液的品質(zhì),還有好多尚未解決的問題需要進行較為深入的研究。想尋求一條純種藏獒也是很困難的。其次藏獒繁殖的季節(jié)性強，母獒每年只有一次發(fā)情，制約了純種藏獒的繁殖和培育。且藏獒精子與其它犬科動物的精子類似，在凍融過程中對低溫損傷的抗性較弱，凍融后精子活力下降，受孕率及窩產(chǎn)仔平均數(shù)均低于自然繁殖。影響犬精液冷凍成功與否的關(guān)鍵是稀釋液配方，稀釋液質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響藏獒精液冷凍與人工受精的成敗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種用于藏獒精子保存的冷凍液，提高了凍精的活力、復(fù)蘇率、頂體的完整率等，從而使受胎率和窩產(chǎn)仔平均數(shù)明顯提高，達到或接近了自交水平。?

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

用于藏獒精子保存的冷凍液，該稀釋液的制備方法是：

A液的各組分及重量為：氯化鈣0.22-0.58g、氯化鉀0.11-0.45g、氯化鋅0.25-0.75g、氯化鈉0.9-1.2g、磷酸二氫鈉0.14-0.70g、醋酸鈉0.21-0.56g、黃芪多糖0.015-0.045g、加雙蒸水定容至500-1000mL而成；

B液的各組分及重量為：取A液35-55mL，小藏獒血清20-30mL、大豆油20-25mL、甘油5-10mL、銀杏總黃酮0.01-0.02g，混合而成用于藏獒精子保存的冷凍液，pH值為6.5-7.0。

黃芪多糖、銀杏總黃酮來自天津尖峰公司。

小藏獒血清的提取純化方法：?

(1)采小藏獒靜脈血，分離出血清：在無菌條件下采6個月以內(nèi)小藏獒靜脈血，放于4℃冰箱中過夜，自然分離出?一部分血清，剩余部分在無菌條件下，10000rpm，4℃離心25分鐘，分離出血清備用；

(2)乙醇除蛋白：按照乙醇和血清體積比為2∶1的量向血清中加入95％乙醇，攪拌，靜置100分鐘，使蛋白質(zhì)變性沉淀，離心(6000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)后留上清棄沉淀；

(3)除乙醇：利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，37℃，1個大氣壓減壓除乙醇；

(4)粗濾：用截留分子量100000D的中空纖維柱粗濾，收集濾液；

(5)酶解：在濾液中加入復(fù)合蛋白酶，每10升血清加入復(fù)合蛋白酶9-10mg，其中纖維素蛋白酶和胃蛋白酶的比例為400∶1；?

(6)離心：在4℃、10000rpm條件下離心30分鐘，棄沉淀留上清；

(7)超濾：用截留分子量5000D的中空纖維柱超濾，收集濾液；

(8)純化：用交聯(lián)葡聚糖G-50凝膠層析脫鹽(層析液為pH?6.8的Tris-?Hcl?緩沖液)，收集?280nm波長紫外線吸收部分，調(diào)pH為7.6；然后選用DEAE-Sephadex-50凝?膠層析(膠床高度和直徑的比為20∶1，柱直徑選用4.5cm)，洗脫液為Tris-?Hcl?緩?沖液，含?NaCl?的濃度為0.07mol/l，1.0?mol/l?，pH為7.9，流速為3-5ml/min，用280nm紫外線檢測，棄去0.07mol/l?NaCl洗脫部分，收集1.0?mol/l?NaCl洗脫部分，減壓濃縮到相對密度?為1.07-1.09；

(9)病毒滅活：采用微孔濾膜濾過+短波紫外線照射進行病毒滅活；采用的微孔濾膜為?0.025微米；用波長為254nm的短波紫外線，強度為1000μw/cm?²?，直接照射時間為10秒；得到小藏獒血清產(chǎn)品。?

小藏獒血清的提取純化方法：?可以按照小牛血清的提取純化方法的方法來制備，只需要將原料由小牛靜脈血換為小藏獒靜脈血就可以了。

本發(fā)明用于藏獒精子保存的冷凍液有以下用途，一是用于藏獒精液低溫保存，如果去掉甘油等低溫保護劑，則還可用于藏獒精液的常溫保存。?

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具體實施例