[發明專利]KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用

無效

• 申請號: 201110365285.5
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102776272A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 吳寶金
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 王江成;朱實

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于KIT信號相關基因檢測的QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用。

背景技術

人KIT原癌基因起源于HZ4貓肉瘤病毒，位于人染色體4q12，在4號染色體長臂中心體周圍區域，是白色斑點顯性基因的等位基因。在小鼠中該基因位于第5號染色體距著絲粒約42cM處。人類KIT基因組DNA全長大約89kb，包括21個外顯子。KIT基因編碼的蛋白質被稱為KIT或c-kit受體，是一個分子量為145kD的I型跨膜性糖蛋白，屬于III型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，分布于細胞膜表面。其結構類似于巨噬細胞集落刺激因子和血小板源生長因子受體，由胞外結構域、單一跨膜區及胞內酪氨酸激酶區域三部分組成。胞外區包含5個免疫球蛋白樣結構域，開始的3個是SCF(干細胞因子)結合區，第4、5個結構域在穩定SCF及誘導KIT受體二聚化方面起重要作用。Broudy等研究發現第5個結構域還與KIT受體從細胞膜上的溶蛋白性裂解有關。胞內部分則包含了由ATP結合區和磷酸轉移酶區組成的具有酪氨酸激酶活性的結構域。其配體為肥大細胞生長因子、干細胞生長因子、steel因子等，以分泌型和膜結合型兩種方式與KIT受體結合。分泌型可使KIT受體激活、內化、降解；膜結合型則能維持KIT受體較長的激活狀態。KIT受體與配體特異性結合可觸發其同源二聚化和細胞膜內酪氨酸殘基的磷酸化，產生停泊位點，捕獲含SH2結構域的信號分子，還能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、Rac1、JNK、Raf-1、JAK2等，通過多種信號因子的參與將細胞外的信號轉導到細胞內部，引發某些基因的特異性表達。SCF/KIT共同參與多種細胞信號的轉導，如：Jak/STAT信號途徑、PI3K途徑、Src家族激酶途徑、Ras/Raf/MEK/ERK信號途徑等，是各種底物激酶的酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的整合步驟，并且存在著多種信號轉導途徑之間的交互作用(cross-talking)，從而精確地調控細胞的增殖和分化。Kit基因突變不僅僅影響黑素細胞的遷徙與分化而導致斑駁病的產生，也會影響原始生殖細胞的發育而導致不孕不育，以及影響造血細胞生成而導致貧血及肥大細胞缺乏等，嚴重的Kit基因突變還會導致純合致死，同時，Kit基因是一個重要的原癌基因，Kit基因高表達會導致粒細胞白血病、精原細胞瘤及消化系統間質腫瘤。SCF/KIT共同參與的多種細胞信號轉導與上述病變密切相關，這些疾病病理發育過程中相關信號過程的變化是近年來kit信號轉導研究中的熱點問題。

QPCR(Real-Time?Quantitative?PCR)在基因表達水平、病原體及產前診斷等方面得到廣泛運用。其原理是在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量，常用的兩種方法為SYBR?Green(熒光染料摻入法)和Taqman?probe(探針法)。SYBR?Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號。熒光染料的優勢在于它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結合，使實驗容易產生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(melting?curve)分析的軟件加以解決。相關論文最早發表于1996年，隨后在實驗方法、儀器設備上進行了一系列改善，已經在科研和臨床診斷領域得到了越來越廣泛的應用。近年來，對于熒光定量PCR的要求越來越規范化。從RNA的提取→RNA完整性和純度的鑒定→逆轉錄→反應體系的優化→最后的數據分析都有一套嚴格的標準，從而增加了熒光定量PCR結果的可靠程度，也使實驗的可重復性得到提高。QPCR芯片是在儀器設備更新的基礎上發展起來的，將近百個或數百個QPCR反應設計在一塊板子上同時進行擴增，以檢測相關基因的表達豐度。

基因芯片是“高通量”現代生物技術的標志，其原理是基于核酸分子雜交，用熒光染料標記樣本DNA或cDNA，與基因芯片雜交，經激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交信號，通過計算機處理、分析，得到所需信息。突出特點在于高通量、微型化和自動化。但它存在三個方面的缺點：1、費用高；2、難以檢測低豐度表達的基因；3、偏重高通量(一次檢測上萬個甚至幾萬個基因)，缺少針對如皮膚、海馬組織或某種腫瘤等特定組織類型的表達“芯片”。