[發明專利]一種L-NCC酰胺水解酶和編碼基因及其重組表達蛋白質的應用

有效

• 申請號: 201110364640.7
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102409033A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 高智慧;劉磊;姚瑞娟;王文芳
• 申請（專利權）人: 天津啟仁醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/12;C12R1/38
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及來源于假單胞菌的一種L-NCC酰胺水解酶的編碼基因，以及重組蛋白質的表達與應用。?

背景技術

N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(N-carbomyl-L-cysteine?amidohydrolase)，即L-NCC酰胺水解酶，是一種催化N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine，L-NCC)水解生成L-半胱氨酸的酶。因為ATC消旋酶催化拆分DL-ATC生成L-ATC；L-ATC水解酶水解ATC噻唑環中C-S單鍵，生成中間產物L-NCC；再經L-NCC酰胺水解酶催化生成終產物L-半胱氨酸，所以L-NCC酰胺水解酶是參與酶法轉化DL-ATC生產L-半胱氨酸的重要成員之一，具體過程參見附圖1。?

L-半胱氨酸(L-cysteine)是組成蛋白質的20種氨基酸之一，是一種α氨基酸，它的存在可以保持蛋白質的穩定性，同一條或不同多肽鏈兩個L-半胱氨酸殘基間以二硫鍵(-S-S-)連接，使蛋白質具有穩定的空間立體結構。L-半胱氨酸在醫藥、食品、飼料、化妝品等行業具有廣泛的用途，日益受到重視。目前L-半胱氨酸的生產方法主要有毛發水解后還原法、化學合成法、發酵法和酶法合成法等。近年來，以微生物為酶源，采用酶法制備氨基酸的技術有了快速的發展。微生物酶法具有特異性強、生產工藝簡單、副反應和副產物少等優點。特別是近年來，以酶法合成替代難于用發酵法生產的氨基酸，有了顯著的進步。目前，有3種微生物酶法轉化合成L-半胱氨酸的工藝路線：(1)以3-氯-L-丙氨酸為前體物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以O-乙酰絲氨酸為前體物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以DL-ATC為前體物的酶法生產L-半胱氨酸。?

DL-ATC是以丙烯酸甲酯為前體物合成的化工產品。對DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸轉化途徑的研究最早開始于1979年，日本學者Sano提出了完成該轉化過程的兩種假設：一種是以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine，L-SCC)為中間產物的S-代途徑；另一種是以L-NCC為中間產物的N-代途徑，反應過程和酶系如附圖1所示。其中以L-NCC為中間產物的轉化途徑最初于1998年由Tamura報道。該學者對L-半胱氨酸合成菌株假單胞菌ON-4a和惡臭假單胞菌AJ3865進行研究，誘導實驗發現，如果分別以DL-ATC、L-NCC和L-SCC為誘導物進行細胞培養，誘導后的細胞加入不同的底物進行酶活測定，僅DL-ATC誘導后的細胞具有L-ATC水解酶活性；而且各種細胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而無L-SCC酰胺水解酶活性，而且各種細胞均不能夠利用N-氨甲酰-D-半胱氨酸、L-SCC和S-氨甲酰-D-半胱氨酸為底物進行酶促反應生成L-半胱氨酸。Tamura還對中間產物進行了純化，純化后的產物經過紅外光譜掃描、質譜分析、核磁共振分析和元素分析，結果與標準的L-NCC完全相同，因此證明了這兩株菌進行以L-NCC為中間產物的L-半胱氨酸合成代謝?途徑。?

目前，有關酶法合成L-半胱氨酸相關酶系的報道不多。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新的L-NCC酰胺水解酶及其編碼基因，獲得活力較高的重組酶，并且這種L-NCC酰胺水解酶可在酶法制備L-半胱氨酸中應用。?

本發明從污泥中分離得到了一株新的假單胞菌Pseudomonas?sp.QR-101，于2011年10月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號CGMCC?No.5315。該菌株進行以L-NCC為中間產物的L-半胱氨酸合成代謝途徑，涉及ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶等3個酶的協同催化作用。?

本發明提供的L-NCC酰胺水解酶，來源于假單胞菌Pseudomonas?sp.QR-101，是序列表中SEQ?ID?No.1的氨基酸殘基序列或將SEQ?ID?No.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的替代或添加且具有與SEQ?ID?No.1相同活性的由SEQ?ID?No.1衍生的蛋白質。?

序列表中SEQ?ID?No.1的氨基酸殘基序列是由420個氨基酸殘基組成的蛋白質。?

本發明所提供的L-NCC酰胺水解酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一：?

(1)是序列表SEQ?ID?No.2的核苷酸序列，由1260個堿基組成；?

(2)編碼序列表中SEQ?ID?No.1蛋白質序列的多核苷酸序列。?