[發明專利]一種人源抗鼻咽癌LMP1胞外區抗體及其應用有效

申請號：	201110364065.0	申請日：	2011-11-17
公開（公告）號：	CN102516388A	公開（公告）日：	2012-06-27
發明（設計）人：	陳仁杰;張大為;朱進;馮振卿	申請（專利權）人：	南京醫科大學第二附屬醫院
主分類號：	C07K16/08	分類號：	C07K16/08;C12N15/13;C12N15/63;A61K47/48;A61K31/407;A61P35/00
代理公司：	南京天華專利代理有限責任公司 32218	代理人：	徐冬濤;劉成群
地址：	210011 江***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種人源抗鼻咽癌 lmp1 胞外區抗體及其應用
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【說明書】：

技術領域：

本發明屬于基因工程領域和免疫靶向診療領域，涉及一種人源抗鼻咽癌LMP1胞外區抗體及其應用。

背景技術：

鼻咽癌是來源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，腫瘤進展極易侵犯顱底等重要結構，并較早發生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。鼻咽癌表現為種族和地區分布的特點，是我國十大高發惡性腫瘤之一，其發病率為20/100,000，已引發嚴重健康問題。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒(EBV)的潛伏感染、環境因素和宿主的基因遺傳因素共同參與的多步驟交互作用而逐步形成的復雜性疾病。所有的鼻咽癌細胞都含有EBV基因組，并表達EBNA1，EBER1，EBER2，和LMP1，LMP2A，LMP2B，這使得這些病毒蛋白成為理想的腫瘤標志物，其中LMP1(latent?membrane?protein1，LMP1)在鼻咽上皮細胞的轉化和癌變過程中的作用倍受關注，是目前公認的病毒癌基因。它以其獨特的蛋白分子結構參與鼻咽癌發生和發展的全過程。

目前還沒有一種能夠具有靶向作用的人源抗鼻咽癌LMP1胞外區抗體。

發明內容

本發明目的是提供一種人源抗鼻咽癌LMP1胞外區抗體。

本發明另一個目的是提供上述抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMP1胞外區的藥物中的應用。

本發明還有一個目的是提供能夠靶向作用于人類鼻咽癌LMP1胞外區的藥物。

發明人通過建立潛伏膜蛋白1(LMP1)胞外區-GST融合蛋白作為抗原，以噬菌體抗體展示技術，利用細胞與抗原固相篩選相結合的方法進行篩選人源噬菌體抗體庫(Fab抗體庫)。多輪篩選后經噬菌體酶聯免疫吸附反應(phage?enzyme?linked?immunosorbent?assay，phage?ELISA)進行陽性克隆鑒定。篩選出人源抗LMP1胞外區抗體Fab(命名為HLEAFab)。原核表達HLEAFab抗體，表達蛋白產物使用Protein?L親和層析柱純化；純化產物經ELISA、流式細胞技術以及免疫熒光技術進行鑒定。進一步通過體外實驗顯示該抗體與鼻咽癌細胞HNE2-LMP1胞外區特異性結合特性和靶向功能。在此基礎上，靶向鼻咽癌細胞LMP1胞外區人源抗體Fab結合絲裂霉素C制備免疫毒素HLEAFab-絲裂霉素C(HLEAFab-MMC)。MTT法檢測HLEAFab-MMC對人鼻咽癌細胞系HNE2-LMP1生長的抑制作用；流式細胞術檢測HLEAFab-MMC對鼻咽癌細胞HNE2-LMP1細胞凋亡和細胞周期的影響。觀察靶向鼻咽癌細胞LMP1胞外區人源抗體Fab-MMC免疫毒素體內抑瘤效應。

本發明的目的是通過下列措施實現的：

一種人源抗鼻咽癌LMP1胞外區抗體，該抗體的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，重鏈可變區氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述的抗體，其中編碼其輕鏈可變區氨基酸的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，編碼其重鏈可變區氨基酸的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

所述抗體的表達載體，該表達載體為質粒、噬菌粒或噬菌體。

所述的抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMP1胞外區的藥物中的應用

一種藥物組合物，含有上述抗體和抗鼻咽癌藥物。

所述的藥物組合物，其中上述抗體與抗鼻咽癌藥物化學偶聯。

所述的藥物組合物，其中抗鼻咽癌藥物為絲裂霉素。

本發明有益效果：

本發明利用基因重組技術，以噬菌體抗體展示技術篩選人源抗LMP1胞外區抗體Fab，并制備靶向作用于鼻咽癌的免疫毒素HLEAFab-絲裂霉素C(HLEAFab-MMC)，為鼻咽癌治療提供了更多的藥物選擇。

附圖說明

圖1.LMP1胞外區融合基因在大腸桿菌系統中的表達。其中：M：蛋白標準分子質量；1：pGEX-4T-2載體誘導純化后的GST蛋白；2：pGEX-LED1誘導后的重組菌；3：誘導前的重組菌；4：非重組菌BL21(DE3)。