[發明專利]玉米逆境誘導型啟動子及活性分析

無效

• 申請號: 201110363677.8
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號: CN102417909A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 潘洪玉;王鳳婷;劉金亮;張世宏;賈承國;李桂華
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/11;A01H5/00
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術領域

本發明屬生物工程技術領域，具體涉及一種來源于玉米干旱DRE-binding?protein3基因并在植物中高度表達的干旱誘導型啟動子序列，還涉及含有該啟動子序列的植物干旱誘導型表達載體，以及應用該啟動子生產轉基因植物。

背景技術

逆境脅迫是目前農業生產中影響糧食產量最重要的因素和挑戰之一。土壤退化、淡水匱乏、氣候(象)多變等因素導致扣除零產出的荒蕪、鹽堿、灘涂地(15億畝以上)外，每年直接由鹽堿、干旱、低溫等逆境脅迫造成的農作物減產仍超過總產的20％左右。在這些嚴重影響農作物生產的逆境因子中，干旱和鹽脅迫是最主要的因素。據統計，全國每年有7億畝農田受旱災威脅，干旱所造成的損失幾乎是其它自然災害所造成損失的總和。特別是擔負我國糧食生產任務65％以上的華北、東北和西北，恰恰是我國最缺水和最干旱的地區。

解決糧食生產中嚴重的多元逆境脅迫問題，提高其產量，除了常規育種技術以外，基于基因遺傳轉化的生物育種技術是一個重要的選擇。通過轉基因技術提高作物抗逆性是有效應對逆境挑戰的根本途徑，而分離、克隆抗逆關鍵基因是解決這一重要問題的核心與關鍵，克隆和組建逆境誘導型啟動子是進行多抗基因轉化實現分子育種目標的重要保障。目前，從實踐上應用的啟動子來看，仍以CaMV35S、玉米Ubiquitin?promoter等組成型表達啟動子為主，而且多為天然分離DNA片段的直接應用，無法實現高效、可控和特異(定點、定時、定量)的調控，而且由35S啟動的基因過表達會使轉基因植物表型產生一些負面效應，如矮化等。因此克隆并應用脅迫誘導型啟動子來啟動抗逆基因的表達，在提高植物的抗性方面具有重要作用。

目前，許多學者對逆境脅迫誘導型啟動子進行了研究。如：rd29A啟動子是缺水等逆境誘導啟動子。Kasuga等用組成型的CaMV?35S啟動子和rd29A啟動子分別驅動DREB1A基因轉化擬南芥(Kasuga?M，Liu?Q，Miura?S，，1999)。CaMV?35S啟動子驅動的DREB1A基因的過量表達激活了許多其他耐脅迫基因的表達，例如rd29A、Kin?1、Cor6.6等。轉基因植株都比非轉基因植株的抗旱、抗鹽、抗凍能力顯著提高。但是，過量表達DREB1A基因也導致了植株在正常生長條件下生長遲緩；與之相反，由脅迫誘導型啟動子rd29A驅動的基因表達不僅使植株有更強的脅迫耐受力還對其生長有著最小的負面影響。OsABA2基因編碼玉米黃質環氧化酶。OsABA2基因啟動子含有一個MYBR元件和5個MYCR元件，表明它的表達與響應ABA誘導有關。Rai等用OsABA2基因啟動子與GUS構建的表達載體轉化玉米，實驗表明在沒有脅迫的條件下，由OsABA2基因啟動子驅動的的轉基因株系的GUS活性要比由Act1驅動的對照組低得多。缺水處理后，葉片中由OsABA2基因啟動子驅動的GUS的表達量是無缺水處理對照組的5倍；而由Act1啟動子驅動的對照組GUS的表達量沒有任何增加(Rai?M，He?CK，2009)。cor15a基因啟動子具有低溫誘導表達的特性，朱青等從擬南芥Columbia生態型的基因組中擴增出cor15a基因的啟動子片段，將其插入pBI121的GUS基因和NOS終止子上游構成表達載體pLB，獲得轉化株。GUS組織染色結果表明，經過低溫處理的轉基因馬鈴薯的葉片均表達了GUS產物，而沒有經過低溫處理的轉基因馬鈴薯及非轉基因植株則檢測不到GUS活性(朱青，宋波濤等，2004)。Rrandl等分析了大豆Gmhsp17.32B熱誘導啟動子在轉基因煙草中的調節作用，并在轉基因植物的種子上測得GUS活性，發現該啟動子具有一段熱誘導因子(HSE)的同功序列。杜鵑等從小麥中克隆了mwcs120啟動子，構建了誘導型瞬時表達質粒pmwGUS，用pmw-GUS轉化玉米愈傷組織和煙草葉片證明，mwcs120啟動子在單子葉和雙子葉植物中均可受低溫等逆境誘導，可以用于驅動結構基因的表達(杜娟，朱禎，李晚忱，2005)。Nazmul等分離了1.6kb的AmCMO基因上游啟動子片段，5′端缺失分析發現，翻譯起始點上游410bp片段中含有鹽脅迫響應序列，300mmol/L?NaCl處理24h后，GUS活性顯著提高，AmCMO基因上游410bp片段可以作為鹽誘導啟動子(Nazmul?HB，Akira?H，Nana?Y，2007)。