[發(fā)明專(zhuān)利]轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110363623.1
• 申請(qǐng)日: 2011-11-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102409092A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋君;張富麗;劉勇;王東;尹全;劉文娟;常麗娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 成都頂峰專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 51224
• 代理人: 成實(shí)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及基因的定量的分析方法。

背景技術(shù)

國(guó)際上很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國(guó)尚無(wú)具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值。為了打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時(shí)彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系，更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法已成為必要。

并且目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米NK603的檢測(cè)技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法和標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)關(guān)于擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米NK603及產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特異性某特定位點(diǎn)（基因序列）的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米NK603及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要包括以下步驟：

合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，Construct603-F:?5'-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'

下游引物序列，Construct603-R:?5'-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3'

熒光探針序列，Construct603-P:?5'-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3'；

（2）制備N(xiāo)K603品系的DNA稀釋液；

（3）配制PCR反應(yīng)體系；

（4）定量PCR檢測(cè)。

進(jìn)一步，步驟（1）所述合成的引物及熒光探針的濃度都為10μmol/l，步驟（2）所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/μl。

為了達(dá)到最好的檢測(cè)效果，步驟（3）所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3μl的DNA稀釋液加入到25μl反應(yīng)體系中，所述25μl的反應(yīng)體系包括以下組分：

Taqman?Master?mix????????????????????????12.5μl

上游引物?????????????????????????????????1μl

下游引物?????????????????????????????????1μl

熒光探針?????????????????????????????????0.5?μl

水???????????????????????????????????????10ul。

作為最優(yōu)的反應(yīng)條件，所述PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，59℃退火60s，45個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

1、本發(fā)明打破了歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘。

2、本發(fā)明彌補(bǔ)和完善了我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系。

3、本發(fā)明提供的檢測(cè)技術(shù)可更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)。

4、本發(fā)明擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。

實(shí)施例

轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要包括以下步驟：

（1）合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，Construct603-F:?5'-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'

下游引物序列，Construct603-R:?5'-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3'

熒光探針序列，Construct603-P:?5'-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3'。

本實(shí)施例引物及熒光探針的合成濃度都為10μmol/l。

以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米NK603及產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特異性某特定位點(diǎn)，即目的基因與調(diào)控元件特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)；通過(guò)該設(shè)計(jì)就可以精準(zhǔn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中NK603的轉(zhuǎn)化事件。

（2）制備N(xiāo)K603品系的DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米NK603中提取出濃度為50ng/μl的DNA稀釋液。