[發(fā)明專利]布魯氏菌檢測用雜交瘤細(xì)胞株17C8及其產(chǎn)生的單克隆抗體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110363295.5
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號(hào): CN102391993A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪舟佳;陳澤良;王玉飛;于爽;杜昕穎;苑錫銅;袁靜;黃留玉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577
• 代理公司: 北京尚誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細(xì)胞株17C8及其產(chǎn)生的單克隆抗體。

背景技術(shù)

布魯氏菌病是一種由布魯氏菌引起的人畜共患病。布魯氏菌能引起哺乳動(dòng)物的流產(chǎn)、不孕、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等，同時(shí)由于它容易形成氣溶膠，具有很高的傳染性，所以還被用作生物戰(zhàn)劑。

傳統(tǒng)的布魯氏菌檢測采用血清學(xué)的方法，主要包括玫瑰花環(huán)試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、抗人球蛋白試驗(yàn)(COOMB’S)，以及能夠標(biāo)準(zhǔn)化的ELISA方法等。血清學(xué)方法的不足之處在于它的敏感性較低，而且與霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏、EHEC、沙門氏菌、福氏志賀菌等容易發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，制備布魯氏菌高親和力的單克隆抗體，且制備的抗體能夠識(shí)別各個(gè)種型的布魯氏菌，將為布魯氏菌病診斷方法的研究奠定很好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供用于布魯氏菌檢測的雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的單克隆抗體。

本發(fā)明所提供的以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細(xì)胞株，名稱為17C8，細(xì)胞株17C8已于2011年6月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.4971。

由雜交瘤細(xì)胞株17C8產(chǎn)生的單克隆抗體命名為17C8anti，來源于小鼠屬小鼠(Mus?musculus)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

17C8?CGMCC?No.4971產(chǎn)生的單克隆抗體與所有布魯氏菌毒株(如544A、16M、臨床株S95(與16M為同種菌)等)以及疫苗株(如S2、S19、M5、104M等)均能夠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種制備上述單克隆抗體的方法。

具體來講，本發(fā)明單克隆抗體的制備方法，可包括以下步驟：

1)用布魯氏菌全菌抗原作為免疫原免疫動(dòng)物；

2)分離免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞；

3)篩選并培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞；

4)從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動(dòng)物的腹水液中分離并純化出單克隆抗體。

在上述單克隆抗體的制備方法中，步驟1)中的布魯氏菌全菌抗原可為活菌或滅活菌，優(yōu)選為活菌抗原，濃度為1×10⁸-1×10⁹CFU/mL；用于制備單克隆抗體的免疫動(dòng)物可為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為小鼠。

步驟2)中當(dāng)被免疫動(dòng)物的血清抗體水平達(dá)到峰值時(shí)，可分離動(dòng)物的脾細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液。必要時(shí)，可使用免疫吸附方法篩選脾細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)娜诤蟿?如聚乙二醇)的誘導(dǎo)下與骨髓瘤細(xì)胞(優(yōu)選為小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0)融合以形成雜交瘤。

步驟3)中可以在選擇性培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)一步可使用流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽性抗性細(xì)胞株。

步驟4)中可于體外(如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌區(qū)分布魯氏菌毒株和疫苗株的單克隆抗體的雜交瘤，并從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化出單克隆抗體。

本發(fā)明還提供了一種檢測布魯氏菌的試劑盒。

本發(fā)明所提供的檢測布魯氏菌的試劑盒，包含有雜交瘤細(xì)胞株17C8?CGMCC?No.4971產(chǎn)生的單克隆抗體。

本發(fā)明提供了以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細(xì)胞株17C8?CGMCC?No.4971及其產(chǎn)生的單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)證明，雜交瘤細(xì)胞株17C8?CGMCC?No.4971產(chǎn)生的單克隆抗體與所有布魯氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能夠反應(yīng)，與其它菌株不反應(yīng)，特異性較高，因而可用于布魯氏菌的檢測中。根據(jù)本發(fā)明單抗株的特征，可以建立檢測布魯氏菌抗原和血清的方法，應(yīng)用前景廣闊。

生物材料說明：

本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株，名稱為17C8，為單克隆細(xì)胞株，該細(xì)胞株已于2011年6月16日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.4971。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1為小鼠三次免疫后的血清抗體效價(jià)趨勢圖

圖2為三次亞克隆后挑選細(xì)胞上清ELISA檢測結(jié)果

圖3A-圖3C為擴(kuò)大培養(yǎng)各代雜交瘤細(xì)胞抗體效價(jià)檢測結(jié)果

具體實(shí)施方式