[發明專利]一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法

無效

• 申請號: 201110362634.8
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號: CN102426157A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 周楠迪;李颯;田亞平;毛浪勇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N1/38
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明是關于一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法，屬于分析化學技術領域。

背景技術

酪氨酸酶（EC?1.?14.?18.?1，Tyrosinase），又稱為多酚氧化酶，是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動植物及人體中。酪氨酸酶主要參與兩個反應過程：催化L-酪氨酸羥基化轉變為L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經一系列反應后形成黑色素。酪氨酸酶在生物體中具有重要的生理功能，是黑色素生物合成途徑中的關鍵酶，與人體雀斑、褐斑等黑色素過度沉積等疾病的發生有關，與昆蟲的蛻皮和果蔬的褐化也有很大關系。因此對酪氨酸酶的活性水平的檢測，不僅能為臨床疾病如惡性黑色素瘤等診斷和治療提供依據，同時在食品工業中果蔬保鮮及環境監測等多個領域有重要的意義。

目前國內外已經有報道的關于酪氨酸酶的活性測定的方法主要包括分光光度法、免疫檢測法、放射性同位素檢測法、高效液相色譜法、熒光檢測法等。但這些方法都存在一些局限性。分光光度法操作相對簡單，分析時間較短因而是目前酪氨酸酶活性分析中最為常用的方法，但該方法存在著一些不足之處，包括L-左旋多巴的成本較高，檢測靈敏度不夠高，如果樣品組分復雜則干擾因素較多，對于組織細胞樣品中的酶活性進行分析時存在缺陷；免疫檢測、放射性同位素、高效液相色譜、熒光檢測法等方法操作復雜、分析時間長、分析成本高等，因此很難發展成通用的分析手段。近年來一些基于納米材料或聚合物的電化學、熒光等方法用于酪氨酸酶的活性分析也得到報道，但是這些方法在檢測限、靈敏度或者是檢測的線性范圍等方面都存在一定的缺陷，尚不能應用于對不同生物來源的樣品中酪氨酸酶活性進行定量分析。

發明內容

本發明目的是將納米生物技術、光譜學檢測等諸多技術的優勢聯合起來，建立一種簡便快速、成本低，而又具有極高靈敏度的酪氨酸酶活性分析方法。

本發明的技術方案：一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法，以兩端均為酪氨酸的寡肽作為酪氨酸酶的底物，在酪氨酸酶的催化和有氧存在的條件下，生成兩端帶有鄰苯二酚基團的衍生物，并進一步生成鄰苯二醌衍生物，加入抗壞血酸后，鄰苯二醌衍生物還原重新生成鄰苯二酚衍生物，后者能夠作為配基與硼酸基團結合，從而當酪氨酸酶的產物兩端帶有鄰苯二酚基團的衍生物存在時，作為橋聯分子使得表面修飾有16-巰基十六烷基酸MHDA及3-氨基苯基硼酸APBA修飾的功能化金納米顆粒APBA/MHDA/AuNPs發生聚集，根據隨之產生的紫外-可見光譜的變化對酪氨酸酶的活性進行分析。

方法包括以下步驟：金納米顆粒（AuNPs）的制備及濃縮、功能化金納米顆粒APBA/MHDA/AuNPs的制備、酪氨酸酶的酶促反應和反應產物的還原、酶活性的紫外-可見光譜檢測。

（1）金納米顆粒（AuNPs）的制備及濃縮

所用玻璃器皿均經王水浸泡，純水沖洗后晾干備用。將100?mL?0.01%的氯金酸水溶液加入250?mL圓底燒瓶，攪拌并加熱至沸騰，劇烈攪拌下快速加入3.5?mL?1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱攪拌15?min后溶液變成酒紅色，停止加熱，繼續攪拌30?min，室溫自然冷卻。所得AuNPs粒徑為13?nm，濃度為3.5?nM。??

取20?mL?3.5?nM的AuNPs溶液放入50?mL圓底離心管中，于4℃下13000?rpm離心20?min，棄去上清液，沉淀重新懸浮于4?mL?1mM、pH?7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，得到濃度為17.5?nM的濃縮AuNPs溶液。

（2）功能化金納米顆粒APBA/MHDA/AuNPs的制備