[發明專利]黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物無效
申請號: | 201110361893.9 | 申請日: | 2011-11-15 |
公開(公告)號: | CN102399878A | 公開(公告)日: | 2012-04-04 |
發明(設計)人: | 班麗萍;蔣湘;劉聰;樊武疆;王新國;林惠嬌;呂英姿;劉二龍 | 申請(專利權)人: | 中國農業大學 |
主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68;C12N15/11 |
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摘要: | |||
搜索關鍵詞: | 黑斑 花斑 鑒定 方法 及其 專用 引物 | ||
技術領域
本發明涉及生物技術領域,尤其涉及一種黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物。
背景技術
斑皮蠹屬害蟲是重要的倉儲害蟲。目前對斑皮蠹的鑒定,主要根據形態學特征進行判別。但由于斑皮蠹類成蟲個體一般都比較小,且種間的形態差異不明顯,經常造成鑒定中的種間混淆。
皮蠹個體小,成蟲體長2.0-3.5mm,且形態酷似不易區分。對成蟲的鑒定,主要根據觸角棒節數、觸角窩深淺、鞘翅顏色及斑紋特點等來鑒別;幼蟲體長4.0-6.0mm,一般是根據著生的剛毛數量和類型、第8腹節背板前脊溝是否完整和上內唇感覺乳突的個數等來鑒別。皮蠹的形態鑒別需要解剖后在顯微鏡下觀察,例如兩者幼蟲最重要的鑒別特征為觸角和上內唇,只有0.1-0.2mm大小,而其上的特征,如剛毛和乳突就更加細小,因此稍有不慎就可能將其破壞或丟失。這就不但需要鑒定工作者有豐富的技術經驗并且還得保證皮蠹害蟲的完整性,從而使得皮蠹近緣種害蟲的形態鑒定成為了日益費時費事的難題。
COI基因是動物線粒體DNA中非常保守的編碼蛋白基因,它具有相對的保守性同時又有足夠的變異,即使是親緣關系很近的類群也存在幾個百分比的差異,所以COI常被用來反映種群遺傳變異信息,分析親緣關系較近的種、種下分類單元等。COI的序列差異性分析在雙翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、纓翅目等昆蟲的鑒別中都被用來作為重要的鑒別依據。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失,使序列比對更容易操作。目前,COI序列差異性分析已經成為物種間分類最普遍的分子標記之一。
分子生物學技術手段已被用于昆蟲的鑒定分類中,目前對皮蠹屬近緣種的鑒定,主要采用傳統的形態分類學,盡管也有采用PCR擴增片段,通過測序來鑒定的方法,但耗時且費用高,還沒有相關的快速分子生物學檢測方法。
因此如何能夠快速準確的對斑皮蠹進行鑒定,已成為亟待解決的問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測皮蠹的引物對。
本發明提供的引物對,由引物1和引物2組成;
上述引物對中,所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。
上述引物對中,所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本發明的另一個目的是提供一種檢測皮蠹的試劑。
本發明提供的試劑,由上述引物對和AflII組成。
在上述試劑中,所述引物對和所述AflII為獨立包裝;
在上述試劑中,所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本發明的第三個目的是提供一種檢測皮蠹的PCR試劑。
本發明提供的PCR試劑,由上述的引物對、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成;
在上述PCR試劑中,所述引物對中的各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0.5μM。
在上述PCR試劑中,所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本發明的第四個目的是提供一種檢測皮蠹的試劑盒。
本發明提供的試劑盒,包括上述的試劑或上述的PCR試劑;
在上述試劑盒中,所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
上述引物對或上述試劑或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測皮蠹中的應用也是本發明保護的范圍;
上述應用中,所述皮蠹具體為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本發明的第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測皮蠹的方法。
本發明提供的方法,包括如下步驟:
1)用上述引物對或上述試劑或上述PCR試劑或上述試劑盒中的引物對對待測皮蠹進行PCR擴增,得到擴增產物;
2)分別用AflII酶切步驟1)得到的擴增產物,得到酶切產物,
若所述酶切產物為535bp和347bp大小,則待測皮蠹為或候選為黑斑皮蠹;
若所述酶切產物仍為880bp大小,則待測皮蠹為或候選為花斑皮蠹。
在上述方法的PCR擴增中,以待測皮蠹的基因組DNA為模板;
在上述方法的PCR擴增中,退火溫度為50℃-55℃,在本發明的實施例中采用的退火溫度為55℃。
在上述方法中,檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
本發明的實驗證明,本發明根據斑皮蠹屬種之間線粒體基因序列差異性,尋找斑皮蠹不同種的物種特異性變異位點,建立對這些斑皮蠹種的分子鑒定體系,最終實現檢疫性斑皮蠹及其近緣種的快速、準確、高效鑒定。本發明的優點在于:
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