[發(fā)明專利]液相芯片檢測金黃色葡萄球菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110360554.9
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號: CN102507949A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設計）人: 王振國;蔡陽;劉金華;羅雁非;王亞麗;宋戰(zhàn)昀
• 申請（專利權）人: 吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

技術領域

本發(fā)明屬于免疫技術及食品衛(wèi)生檢測技術領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌存在于自然界的空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中。因而，食品受其污染的機會很多。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。因此建立一種及時，快速，準確的檢測金黃色葡萄球菌的方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種運用液相芯片技術，用于檢測金黃色葡萄球菌的方法，以便實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測。

本發(fā)明由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌單克隆抗體，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，生物素標記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標記的羊抗兔IgG；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結合，以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標記的抗抗體相結合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結合金黃色葡萄球菌的數(shù)量；

捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體

取微球原液室溫恢復30min，用超聲波清洗機進行超聲10min，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布；用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul?的微球原液置于1.5ml的離心管中，14000?rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37℃搖床120?rpm，20min，然后14000?rpm，離心5min，小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37℃搖床120?rpm，孵育2h，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進行洗滌，洗滌后加入500ul?1％BSA的?PBS溶液，重懸微球，37℃水浴搖床孵育兩個小時進行封閉，封閉后4℃保存；

液相芯片檢測金黃色葡萄球菌

將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復10min，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個微球，加入10⁸?CFU/ml?的金黃色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床120rpm，1h，取出后離心棄上清，用200ul?PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體10ul，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床120rpm，1h，取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG?10ul，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床反應1h，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床反應，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于100ul?PBS-TBN中，上機進行檢測。

本發(fā)明液相芯片是集合流式細胞技術、激光技術、數(shù)字信號處理技術及傳統(tǒng)化學技術為一體的新型生物分子檢測技術，其最大的特點是高通量，靈活性好，靈敏度高。運用液相芯片技術檢測金黃色葡萄球菌（staphylococcus?aureus）的方法，以便實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測，為食品安全做出貢獻。

附圖說明

圖1是本發(fā)明捕獲抗體最佳工作濃度；

圖2是本發(fā)明靈敏度檢測結果；

圖3是本發(fā)明特異性的檢測結果；

圖4是本發(fā)明重復性檢測結果；

圖5是本發(fā)明在進行檢測時所顯示微球位置以及數(shù)量的實時圖的點狀圖；

圖6是本發(fā)明在進行檢測時所顯示微球位置以及數(shù)量的實時圖的柱狀圖。

具體實施方式