[發(fā)明專利]液相芯片檢測空腸彎曲菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110360553.4
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN102426233A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王振國;劉金華;蔡陽;羅雁非;劉濤;王亞麗;宋戰(zhàn)昀
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫技術(shù)及食品衛(wèi)生檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

空腸彎曲菌是80年代起受到國內(nèi)外廣泛重視的人畜共同感染的病原菌，可以引起人和動(dòng)物發(fā)生多種疾病，被認(rèn)為是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌，對人的感染率不亞于沙門氏菌和志賀氏菌，是一種重要的食源性病原菌。傳染源主要是動(dòng)物及其污染的食品，彎曲菌屬廣泛散布在各種動(dòng)物體內(nèi)，其中以家禽、野禽和家畜帶菌最多，其次在嚙齒類動(dòng)物也分離出過彎曲菌。目前對于食品中空腸彎曲菌的檢測方法（無論是經(jīng)典方法，還是分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法等）的方法都存在操作繁瑣，需要時(shí)間較長的特點(diǎn)，而且一次只能檢一種菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種運(yùn)用液相芯片技術(shù)，用于檢測空腸彎曲菌的方法，以便實(shí)現(xiàn)對空腸彎曲菌的快速檢測。

本發(fā)明由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，所述微球?yàn)轸然?5號(hào)微球；所述捕獲抗體是空腸彎曲菌單克隆抗體，所述檢測抗體是空腸彎曲菌的多克隆抗體，生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與空腸彎曲菌結(jié)合，以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合空腸彎曲菌的數(shù)量；

液相芯片的制備：捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體

取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機(jī)進(jìn)行超聲10min，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布，用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul?的微球原液置于1.5ml的離心管中，14000?rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37℃搖床120?rpm，20min，然后14000?rpm，離心5min，小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37℃搖床120?rpm，孵育2h，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul?1％BSA的?PBS溶液，重懸微球，37℃水浴搖床孵育兩個(gè)小時(shí)進(jìn)行封閉，封閉后4℃保存；

液相芯片檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法

將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)10min，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個(gè)微球，加入10⁸?CFU/ml?的空腸彎曲菌10ul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到100ul，置于37℃搖床120rpm，1h，取出后離心棄上清，用200ul?PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體10ul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到100ul，置于37℃搖床120rpm，1h，取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG?10ul，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到100ul，置于37℃搖床反應(yīng)1h，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補(bǔ)足體積到100ul，置于37℃搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于100ul?PBS-TBN中，上機(jī)進(jìn)行檢測。

本發(fā)明應(yīng)用液相芯片檢測空腸彎曲菌與其它幾種檢測方法相比，優(yōu)勢在于檢測樣品數(shù)量和檢測項(xiàng)目的雙向高通量（可同時(shí)對大量樣品進(jìn)行多達(dá)96個(gè)項(xiàng)目的檢測）且具有靈活性好、靈敏度高、信噪比好、操作簡便、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，液相芯片技術(shù)作為生物信息學(xué)先進(jìn)的操作平臺(tái)，在臨床診斷、獸醫(yī)傳染病診斷、食品微生物檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)現(xiàn)對空腸彎曲菌的快速檢測，為食品安全做出貢獻(xiàn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明捕獲抗體最佳工作濃度；

圖2是本發(fā)明靈敏度檢測結(jié)果；

圖3是本發(fā)明特異性的檢測結(jié)果；

圖4是本發(fā)明重復(fù)性檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：通過空腸彎曲菌的特異抗體，與微球進(jìn)行偶聯(lián)后，制備出可以對空腸彎曲菌進(jìn)行檢測的液相芯片，在應(yīng)用時(shí)，加入樣品增菌液，使增菌液中的空腸彎曲菌被微球上的捕獲抗體所捕獲，檢測抗體也與空腸彎曲菌結(jié)合后，再與生物素標(biāo)記的抗抗體共同孵育，然后通過生物素與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應(yīng)，應(yīng)用Luminex100檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對空腸彎曲菌的特異檢測。