[發明專利]液相芯片檢測大腸桿菌O157的方法

無效

• 申請號: 201110360550.0
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號: CN102520167A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 王振國;蔡陽;劉金華;羅雁非;王亞麗
• 申請（專利權）人: 吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

1.一種液相芯片檢測大腸桿菌O157的方法，其特征在于：由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其中微球是羧基化的21號微球、捕獲抗體是大腸桿菌O157單克隆抗體、檢測抗體是大腸桿菌O157的多克隆抗體、生物素標記的抗抗體是經活化的生物素標記的羊抗兔IgG，捕獲抗體和檢測抗體均能特異與大腸桿菌O157結合，以紅色激光激發其球型基質上的紅色分類熒光，以綠色激光激發與生物素標記的抗抗體相結合的藻紅蛋白，測定球型基質上結合的報告熒光分子的數量，用于間接確定球型基質上結合大腸桿菌O157的數量；

液相芯片的制備：捕獲抗體與微球偶聯形成偶聯體

取微球原液室溫恢復30min，用超聲波清洗機進行超聲10min，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布，用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul?的微球原液置于1.5ml的離心管中，14000?rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37℃搖床120?rpm，20min，然后14000?rpm，離心5min，小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37℃搖床120?rpm，孵育2h，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進行洗滌，洗滌后加入500ul?1％BSA的?PBS溶液，重懸微球，37℃水浴搖床孵育兩個小時進行封閉，封閉后4℃保存；

液相芯片檢測大腸桿菌O157的方法：

將已偶聯的微球混合液室溫恢復10min，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個微球，加入10⁸?CFU/ml?的大腸桿菌O15710ul，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床120rpm，1h，取出后離心棄上清，用200ul?PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體10ul，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床120rpm，1h，取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG?10ul，用PBS-TBN補足體積到100ul，?置于37℃搖床反應1h，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補足體積到100ul，置于37℃搖床反應，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于100ul?PBS-TBN中，上機進行檢測。