[發明專利]一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201110359143.8
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102397560A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 宮強;程茗;牛明福;孫曉菲;張愛國;孫軍杰;曲寧
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

1.一種禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備方法，其特征在于，其具體步驟為：

步驟一、禽巴氏桿菌的提取

1）取0.1毫升的禽巴氏桿菌，將其接種到10毫升的胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，在37℃條件下，培養18小時，形成菌液，備用；

2）從步驟1）的菌液中提取禽巴氏桿菌基因組，將得到的禽巴氏桿菌基因組放置在-20℃條件下，備用；

步驟二、禽巴氏桿菌基因組的酶切、回收及純化：

1）酶切體系的配制：在0.5ml離心管a中加入42.5微升的禽巴氏桿菌基因組、2.5微升的限制性內切酶?Sau3AⅠ和5微升的10倍限制性內切酶Sau3AⅠ緩沖液，混合均勻，得到50微升的混合物A，將上述含有混合物A的0.5ml離心管a放在溫度為37oC的水浴鍋中，放置4分鐘，取出，再將含有混合物A的0.5ml離心管a放在溫度為75℃的水浴鍋中，放置30分鐘，取出，冷卻至21℃，備用；

2）利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進行檢測

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物A，在凝膠成像系統中確認混合物A中含有酶切后的禽巴氏桿菌基因組的目的基因；

3）用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的禽巴氏桿菌基因組進行回收、純化

取1.5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2）中的凝膠上切下，將切下的混合物A放在已稱重的1.5ml離心管a中，稱取1.5ml離心管a的總重并計算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然后將1.5ml離心管a中的混合物A搗碎，加入與混合物A等體積的DNA純化結合液，混合均勻，將1.5ml離心管a放置在50oC水浴中加熱至混合物A完全融解，得到混合液Ⅰ，將混合液Ⅰ加入到DNA純化柱a上，DNA純化柱a位于收集管a中，將收集管a置于21℃條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內的液體，向DNA純化柱a上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內，后將收集管a在21℃條件下放置1分鐘，后將收集管a送入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a內的液體，向DNA純化柱a上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內，后將收集管a放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱a，倒掉收集管a中的液體后，將DNA純化柱a置于收集管a內，再將收集管a放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a將其放置于1.5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30微升洗脫液，將1.5ml離心管b在21℃條件下放置1分鐘，放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a得到1.5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切并純化后的禽巴氏桿菌基因組，存儲于-20℃條件下，備用；

步驟三、真核表達載體pcDNA3.1(+)的酶切、回收、純化及去磷酸化：

1）酶切體系的配制：在0.2毫升離心管a中加入50微升的真核表達載體pcDNA3.1(+)、10微升的限制性內切酶BamH?I、10微升的10倍的限制性內切酶BamH?I緩沖液和30微升的水，混合均勻，得到的混合物B，將上述混合物B放入37oC的水浴鍋中，反應7小時，備用；

2）利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物B進行檢測

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統中確認混合物B中含有酶切后的真核表達載體pcDNA3.1(+)；

3）用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的真核表達載體pcDNA3.1(+)進行回收、純化

取1.5ml離心管c并稱其重量，在紫外燈下將混合物B從步驟2）中的凝膠上切下，將切下的混合物B放在已稱重的1.5ml離心管c中，稱取1.5ml離心管c的總重并計算出從凝膠上切下來的混合物B的重量，然后將1.5ml離心管c中的混合物B搗碎，加入等體積的DNA純化結合液，混合均勻，將1.5ml離心管c放置在50oC水浴中加熱至混合物B完全融解，得到混合液Ⅱ，將混合液Ⅱ加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中，收集管b在21℃條件下放置1分鐘，將將收集管b放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入700微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內，后將收集管b在21℃條件下放置1分鐘，后將收集管b放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入500微升的洗滌液，將DNA純化柱b置于收集管b內，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀物的DNA純化柱b，倒掉收集管b內的液體，將DNA純化柱b置于收集管b內，然后將收集管b放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1.5ml離心管d中，后在DNA純化柱b上加入40微升洗脫液，將1.5ml離心管d在21℃條件下放置1分鐘，然后將收集管b放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到1.5ml離心管中d中的液體，該液體就是酶切并純化后的真核表達載體pcDNA3.1(+)，備用；

4）真核表達載體質粒pcDNA3.1(+)的去磷酸化

取步驟3）中酶切并回收后的真核表達載體質粒pcDNA3.1(+)40微升并加到0.5毫升離心管b中，然后再在0.5毫升離心管b中加入5微升的10倍小牛小腸堿性磷酸酶緩沖液、2微升的小牛小腸堿性磷酸酶和3微升的水，混合均勻，得到混合物C，將含有混合物C的0.5毫升離心管b放在37℃的水浴鍋中，放置30分鐘，然后在0.5毫升離心管b中加入100微升的無水乙醇，混合均勻，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心10分鐘，離心后倒掉0.5毫升離心管b內沉淀物上層的液體，再向0.5毫升離心管b中加入15微升的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，得到去磷酸化后的真核表達載體pcDNA3.1(+)，存儲于-20℃條件下，備用；

步驟四、禽巴氏桿菌基因組疫苗的制備

1）禽巴氏桿菌基因組與真核表達載體pcDNA3.1(+)的連接：

在1.5ml離心管e中依次加入6微升純化后的禽巴氏桿菌基因組、10微升的真核表達載體pcDNA3.1(+)、2微升的T4?DNA連接酶和2微升的10倍T4DNA連接酶緩沖液，混合均勻，得到的混合物D，將上述含有混合物D的1.5ml離心管e放入16℃的水浴鍋中，反應12小時，待反應結束后，取出備用；

2）將大腸桿菌JM83菌株放置在0oC的冰水混合物中，放置8分鐘，備用；

3）取步驟2）中100微升的大腸桿菌JM83，將其加到含有混合物D的1.5ml離心管e中，混合均勻，得到混合物E，將含有混合物E的1.5ml離心管e置于0oC的冰水混合物中，放置5分鐘，取120微升的混合物E加到0oC的電擊杯內，將電擊杯放到電轉化儀內，進行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1.8千伏，電阻為200歐姆，電擊時間為0.05秒，電擊結束后，取出含有混合物E的電擊杯，然后在電擊杯內加入1毫升的SOC培養基，混合均勻，得到混合物F，將電擊杯內的混合物F轉移到1.5ml離心管f中，將1.5ml離心管f置于37oC的搖床中，轉速225轉/分鐘，振蕩培養為1小時，待培養結束后，取出，取100微升培養后的混合物F，并涂布于含有濃度為60微克/毫升的氨芐青霉素的LB固體培養基上，將涂布后的LB培養固體培養基置于37oC的培養箱內，倒置培養16小時，備用；

4）挑取培養后的LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入30毫升含氨芐青霉素的LB液體培養基中，氨芐青霉素的濃度為60微克/毫升，后將含有氨芐青霉素的LB液體培養基置于37oC恒溫搖床內，轉速為200轉/分鐘，振蕩培養15小時，形成培養液，備用；

5）取1.0毫升的培養液，將其加到1.5ml離心管g中，將1.5ml離心管g放入4℃離心機內離心，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，棄去1.5ml離心管g中沉淀物上層的液體，在1.5ml離心管g中加入100微升4oC的溶液Ⅰ，均勻混合后，加入200微升的溶液Ⅱ，混合均勻，將1.5ml離心管g在21℃條件下放置4分鐘，然后向1.5ml離心管g中加入150微升4oC的溶液Ⅲ，混合均勻，后將1.5ml離心管g放于0oC的冰水混合物中，靜置10分鐘，放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘，4oC的條件下離心10分鐘，取出，備用；

6）取1.5ml離心管g中的上層澄清液體400微升，將其加到1.5ml離心管h中，然后依次向1.5ml離心管h中加入200微升的苯酚和200微升的氯仿，振蕩混勻后，得到混合液Ⅲ，將含有混合液Ⅲ的1.5ml離心管h放入冷凍離心機內，在轉速為13000轉/分鐘，4oC條件下離心10分鐘，待離心結束后取上層液體400微升將其轉移到1.5ml離心管i中，后向1.5ml離心管i中加入400微升氯仿，振蕩混勻后，得到混合液Ⅳ，將含有混合液Ⅳ的1.5ml離心管i放入冷凍離心機內，在轉速為13000轉/分鐘，4oC條件下離心10分鐘，待離心結束后取上層液體400微升將其轉移到1.5ml離心管j中，再向1.5ml離心管j中加入1毫升的無水乙醇，將1.5ml離心管j置于21oC條件下，放置30分鐘，后取出放入離心機內，轉速13000?轉/分鐘，4oC條件下離心20分鐘，棄去1.5ml離心管j中沉淀物上層的液體，得到下部沉淀物Ⅰ，備用；

7）向含有沉淀物Ⅰ的1.5ml離心管j中加入500微升濃度70%的乙醇，混合均勻，轉速為13000轉/分鐘，離心1分鐘，倒掉1.5毫升離心管j中沉淀物上層的液體，得到沉淀物Ⅱ，待1.5毫升離心管j中的沉淀物Ⅱ干燥后，向含有沉淀物Ⅱ的1.5毫升離心管j中加入20微升的PBS溶液，濃度為0.01?mmol/L，pH值為7.2，進行溶解，得到混合液Ⅴ，備用；

8）在1.5毫升離心管k中加入3微升混合液Ⅴ、1微升的限制性內切酶EcoRⅠ、1微升的10倍限制性內切酶EcoRⅠ緩沖液和6微升的水，混合均勻，將1.5毫升離心管k放置于37℃水浴鍋內，放置2小時，形成混合液Ⅵ，即得到禽巴氏桿菌基組疫苗，備用；

9）利用瓊脂糖凝膠電泳對混合液Ⅵ進行檢測

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合液Ⅵ，電泳結束后在凝膠成像系統中觀察到6000bp的條帶時，證明禽巴氏桿菌基組疫苗制備成功；

所述的載體為真核表達載體pcDNA3.1(+)；

所述的LB培養固體培養基的組成成份：按重量百分比LB培養固體培養基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1.5%的瓊脂粉，余量為水；

所述的LB液體培養基的組成成份：按重量百分比LB液體培養基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；

所述胰蛋白胨大豆肉湯培養基的組成成份：按重量百分比胰蛋白胨大豆肉湯培養基中含有1.5%的胰蛋白胨，0.5%的大豆蛋白胨，0.5%的氯化鈉，余量為水；

所述SOC培養基組成成份：按重量百分比SOC培養基中含有2%的胰化蛋白胨、0.5%的酵母提取物、0.05%的氯化鈉、0.02%濃度為2.5mmol/L的氯化鉀、0.1%濃度為10?mmol/L的氯化鎂、0.36%濃度為20mmol/L的葡萄糖，余量為水；

所述PBS溶液組成成份：按重量百分比PBS溶液中含有0.8%的氯化鈉、0.024%的磷酸二氫鉀、0.02%的氯化鉀、0.144%的磷酸氫二鈉，余量為水；

所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份：每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有10mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；

所述電泳緩沖液的組成成份：每升電泳緩沖液中含有40mmol的Tris堿、10?mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；

所述的DNA純化結合液的組成成份：每升DNA純化結合液中含有25mmol的葡萄糖、10?mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；

所述的洗滌液的組成成份：按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；

所述的洗脫液的組成成份：按重量百分比洗脫液中含有40%的濃度10mol/L的乙酸鈉、8.5%的冰醋酸，余量為水；

所述的溶液Ⅰ的組成成份：每升溶液Ⅰ中含有50?mmol的葡萄糖、25?mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10?mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；

所述的溶液Ⅱ的組成成份：按重量百分比溶液Ⅱ中含有0.06%濃度為10mmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；

所述的溶液Ⅲ的組成成份：按重量百分比溶液Ⅲ中含有60%的濃度5?mol/L的乙酸鉀、11.5%的冰醋酸，余量為水。