[發明專利]一種重組花生過敏原與突變體及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201110358700.4
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102584966A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 陶愛林;夏宏林;鄒澤紅;何穎;陳惠芳
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院第二附屬醫院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/70;C12N15/81;C12N15/82;C12N15/29;C12N15/10;A61K39/35;A61P37/08;G01N33/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組花生過敏原與突變體及其制備方法和應用。?

背景技術

花生屬于豆科植物，營養價值豐富，并且氨基酸含量比較均衡，據報道花生中含有45-53%油脂，24-29%蛋白。近年來，過敏反應性疾病得到社會各界的重視，而花生是聯合國糧食及農業組織(FAO)報告中公布的八大過敏食物之一，也是很重要食物過敏原，在食物過敏中非常普遍，占食物過敏總病例數的10%-47%，而且花生過敏的臨床癥狀嚴重，即便食入微量的花生過敏原食物，也可引發強烈的過敏反應，在公共衛生和食品安全領域中備受關注。另一方面，由于交叉過敏的普遍性與復雜性存在，花生過敏與其他類型的過敏存在嚴重的交叉反應，也增加了花生過敏發生的概率。另外，花生過敏不會隨著年齡增長而產生免疫耐受，遷延不愈容易引起其它嚴重疾病。?

目前，治療過敏性疾病主要方法有：1）利用抗組胺藥物以及類固醇藥物可以緩解癥狀，但是不能徹底根除并且還有可能會帶來副作用。2）特異性免疫治療，被認為是過敏性疾病唯一針對病因的治療方法，已得到普遍共識。而目前進行特異性免疫治療主要是采用過敏原浸提液，如此一來另一個問題卻異常突出：由于提取物成分復雜，而且還含有大量非特異性抗原，致使標準化困難，嚴重影響了治療效果和臨床應用規范；同時，由于過敏原性的存在，即使是采用單純的標準化過敏原進行免疫治療也一定的風險。采用生物化學分離和純化技術可以獲得較純過敏原，但是這種方法純化工藝復雜且產量低，要消耗大量人力和財力，因此其廣泛應用受到了較大的限制。?

相比較而言，利用基因工程技術，通過定點突變的方法獲得低過敏原性或無過敏原性的重組花生過敏原的突變體，在一定程度上可從源頭上降低治療過程中的風險，同時能夠保留花生過敏原的生物學活性。另外，重組過敏原的生產條件穩定，且標準化程序簡單，有利于廣泛應用于臨床的診斷和治療。因此，重組弱化過敏原將是一種很好的替代方法，有廣闊的發展前景。?

發明內容

本發明的目的在于針對上述存在的問題及天然花生過敏原提取液的不足，在克隆表達重組花生過敏原的基礎上，利用生物信息學軟件分析花生過敏原的抗原表位，突變一個或多個抗原性高的位點，從而獲得低過敏原性的花生過敏原突變體，期望能夠安全高效地應用于過敏性疾病的治療。?

本發明的另一個目的是提供一種編碼上述重組花生過敏原及其突變體的基因。?

本發明的另一個目的是提供一種含有上述基因的重組質粒載體。?

本發明的另一個目的是提供一種含有上述基因轉化的重組表達宿主。?

本發明的另一個目的是提供一種上述重組花生過敏原及其突變體的制備方法。?

本發明的另一個目的是提供一種重組花生過敏原用作藥物或者診斷試劑的制備方法。?

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：?

本發明的重組花生過敏原，是天然存在的花生過敏原衍生的非天然存在的變異體，其核酸序列經密碼子優化后，人工合成全長的重組花生過敏原基因。采用生物信息學軟件分析其抗原表位，針對一個或多個抗原性指數高的位點進行有目的的置換，獲得重組花生過敏原突變體的基因，使其在保持原有生物學活性和空間結構的基礎上，能夠有效地降低重組花生過敏原的過敏原性。然后利用大腸桿菌表達系統，在人工控制的條件下，獲得高純度的重組花生過敏原及其突變體蛋白。與天然花生過敏原相比，該重組蛋白突變體與特異性IgE的結合性能明顯減少，可安全地應用于過敏性基本的預防和治療。

一種重組花生過敏原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。?

上述重組花生過敏原的突變體，是在重組花生過敏原的突變體的基礎上衍生的突變體，其中B細胞或/和T細胞表位的至少一個表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現的過敏原基本相同的α-碳骨架三級結構。?

本發明重組花生過敏原的突變體的制備方法，是在重組花生過敏原的突變體的基礎上衍生的突變體，其中B細胞或/和T細胞表位的至少一個表面暴露的保守氨基酸殘基被在天然存在的過敏原來源的分類學目內任何已知的同源蛋白質氨基酸序列中的相同位置不出現的另一殘基取代，該突變體具有與天然出現的過敏原基本相同的α-碳骨架三級結構。?