[發(fā)明專利]硫酸軟骨素酶B融合蛋白、其編碼基因以及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110358134.7
• 申請(qǐng)日: 2011-11-11
• 公開（公告）號(hào): CN103103173A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳敬君;李曄;邢新會(huì);張翀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;C12N5/10;C12P19/04
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 賈靜環(huán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域中一種硫酸軟骨素酶B融合蛋白及其編碼基因以及其構(gòu)建方法。此外本文還提供一種純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文還涉及一種生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B的方法。

背景技術(shù)

硫酸軟骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin?sulfaeyase，以下有時(shí)也簡稱為“ChSase”)是一類能將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖(ΔDi及寡糖的裂解酶。近年來，ChSase作為一種研究機(jī)體蛋白聚糖的結(jié)構(gòu)與功能的工具以及作為一種新型藥用酶而日益受到人們的重視。硫酸軟骨素酶B(以下有時(shí)也簡稱為“ChSase?B”)可特異性降解硫酸皮膚素及透明質(zhì)酸為ΔDi-0s及寡糖。

因ChSase?B僅特異性降解硫酸皮膚素(也稱為硫酸軟骨素B)及透明質(zhì)酸，所以對(duì)該酶的藥用價(jià)值的研究比較另一種硫酸軟骨素酶AC(以下有時(shí)也簡稱為“ChSase?AC”)要少一些，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)ChSase?B也有著不可忽視的應(yīng)用價(jià)值：在基礎(chǔ)理論方面，利用ChSase?B可特異性的降解硫酸軟骨素蛋白聚糖中硫酸軟骨素側(cè)鏈，許多科研人員通過對(duì)機(jī)體組織特定部位的硫酸軟骨素的降解，并通過該部位硫酸軟骨素降解前后功能的改變及降解產(chǎn)物的分析，來了解硫酸軟骨素的結(jié)果與功能(參見：Shibata?S，Midura?RJ，Hascall?UC.Structural?analysis?of?the?linkage?region?oligosaccharides?and?unsaturated?disaccharides?from?chondroitin?sulfate?using?Carbopac?PA.J?Biol?Chem，1992，267(10)：6548-6555)。

在臨床運(yùn)用領(lǐng)域，近年來研究非常活躍，研究表明，硫酸軟骨素糖胺聚糖與腫瘤細(xì)胞的侵入、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(參見：Henke?CA，Roongta?V，Mickelson?DJ，et?al.CD44-related?chondroitin?sulfate?proteoglycan，a?cell?surface?receptor?implicated?with?tumor?cell?invasion，mediates?endothelial?cell?migration?on?fibrinogen?and?invasion?into?a?fibrin?matrix.J?Clin?Invest，1996，97(11)：2541-2552)。2001年Denholm?EM等發(fā)現(xiàn)ChSase?B能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與增生等(參見：Denholm?EM，Lin?YQ，Silver?PJ.Anti-tumor?activities?of?chondroitinase?AC?and?chondroitinase?B：inhibition?of?angiogenesis，proliferation?and?invasion.Eur?J?Pharmacol，2001，416(3)：213-221)。

在制藥領(lǐng)域，硫酸軟骨素是一種具有較強(qiáng)的降血脂作用和緩沖抗凝血作用的物質(zhì)，臨床上主要用于防止冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化。目前，對(duì)低分子量硫酸軟骨素的制備常采用酸水解法、離子交換法和酶解法。前兩種方法需要較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備并且會(huì)污染環(huán)境，比較而言，酶解法需要的條件不高且容易控制，因而具備較大的優(yōu)勢(shì)。酶解法的關(guān)鍵在于獲得大量的硫酸軟骨素裂解酶，其中包括ChSase?B的獲得。