[發(fā)明專利]鴨Ⅰ型肝炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110356501.X
• 申請(qǐng)日: 2011-11-11
• 公開（公告）號(hào): CN102344973A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;謝麗基;劉加波;謝志勤;龐耀珊;鄧顯文;范晴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 翁建華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鴨I型肝炎病毒檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種鴨I型肝炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒。?

背景技術(shù)

鴨I型肝炎病毒(Duck?Hepatitis?Virus?type?I)是一種針對(duì)雛鴨的高度致死性病毒性傳染病的病原。該病主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，死亡率高達(dá)90％以上，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。?

鴨I型肝炎病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等，但這些檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。目前，雖已建立起鴨I型肝炎病毒PCR檢測(cè)方法和熒光定量PCR檢測(cè)方法，其檢測(cè)敏感性也比較高，但是常規(guī)PCR需要使用PCR儀和進(jìn)行凝膠電泳，熒光定量PCR則需要使用更加昂貴的熒光定量PCR儀和試劑等，因而難以適應(yīng)基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、儀器要求低、操作快速簡(jiǎn)便且成本低的鴨I型肝炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，以滿足基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)鴨I型肝炎病毒的需要。?

為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：?

鴨I型肝炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，試劑盒含有以下試劑：?

反應(yīng)液A：含有10×等溫反應(yīng)緩存液、5U/ul?AMV、40U/ul?inhibitor、Bst?DNA聚合酶8U/ul、10mM?dNTPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物1、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物1、20uM的環(huán)引物2、5M甜菜堿、625μM鈣黃綠素和12.5mM氯化錳；10×等溫反應(yīng)緩存液含有200mM?pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；?

內(nèi)引物1序列為CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA，?

內(nèi)引物2序列為CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG，?

外引物1序列為GTACCATAAACCTGTTTTTCCT，?

外引物2序列為GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT，?

環(huán)引物1序列為TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA，?

環(huán)引物2序列為TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC。?

反應(yīng)液A每管24μL，其組成為：2.5ul?10×等溫反應(yīng)緩存液、1ul?5U/ul?AMV、1ul?40U/ulinhibitor、1.0ul?Bst?DNA聚合酶8U/ul、3.5ul?10mM?dNTPs、5ul?25mM硫酸鎂、0.25ul20uM的內(nèi)引物1、0.25ul?20uM的內(nèi)引物2、2ul?20uM的外引物1、2ul?20uM的外引物2、1ul?20uM的環(huán)引物1、1ul?20uM的環(huán)引物2、0.5ul?5M甜菜堿、1ul?625μM鈣黃綠素和1ul?12.5mM氯化錳和1ul雙蒸水。?

本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)鴨I型肝炎病毒共有的基因保守區(qū)(見序列表SEQ.ID.No.1)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物和兩個(gè)特異性環(huán)引物，由此發(fā)明了用于快速檢測(cè)鴨I型肝炎病毒的鴨I型肝炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測(cè)試劑盒建立鴨I型肝炎病毒檢測(cè)方法，僅需通過對(duì)組織樣品進(jìn)行RNA提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可檢測(cè)出鴨I型肝炎病毒。該法無需昂貴的PCR儀只需普通水浴鍋，卻比PCR檢測(cè)有更高的靈敏度，且不必通過凝膠電泳觀察結(jié)果，操作簡(jiǎn)單而快速，特別適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。?

另外，常規(guī)的LAMP方法，需要在反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入SYBR?Green?I或Gene?Finder染料來顯色，容易造成假陽性：一方面，反應(yīng)產(chǎn)物易形成氣溶膠而污染周圍環(huán)境造成假陽性；另一方面，SYBR?Green?I或Gene?Finder染料還會(huì)由于引物二聚體而引起假陽性。因此，本發(fā)明使用內(nèi)加鈣黃綠素+氯化錳替代了外加的SYBR?Green?I和Gene?Finder染料，即在配置LAMP反應(yīng)液時(shí)就加入反應(yīng)液中而無需LAMP反應(yīng)后再開蓋加入；而且，鈣黃綠素+氯化錳僅在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才出現(xiàn)綠色，避免了SYBR?Green?I和Gene?Finder染料帶來的假陽性問題，所以具有更好的特異性。?

附圖說明