[發明專利]一種微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝

有效

• 申請號: 201110356249.2
• 申請日: 2011-11-10
• 公開（公告）號: CN102433364A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 王福清;徐莉;張桐
• 申請（專利權）人: 中科醫藥行業生產力促進中心有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C07D498/18;C12R1/55
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

1.一種微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其為特征是，所述微生物為吸水鏈霉菌Streptomyces?hygroscopicus，CGMCC?No.5145。

2.如權利要求1所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其特征是，包括以下步驟：

步驟一、先在斜面培養基中培養吸水鏈霉菌Streptomyces?hygroscopicus，CGMCC?No.5145，至斜面菌苔表面出現吸水黑斑，然后用接種鏟從斜面上取一環菌種轉接于新鮮種子培養基中進行培養；

步驟二、將經所述種子培養基中培養的菌株按照2％的接種量接種至新鮮的發酵培養基中進行發酵培養，得到含有雷帕霉素的發酵液。

3.如權利要求1所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其特征是在步驟二之后還包括步驟三：利用高帕霉素在水和有機溶劑中的溶解度差異，分離和純化發酵液中的雷帕霉素。

4.如權利要求2所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，所述斜面培養基中培養條件：溫度26～30℃，培養時間14～16天。

5.如權利要求2所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，所述種子培養條件：溫度26～30℃，菌株于錐形瓶中在轉數為180～220rmp的搖床上振搖培養，培養時間55～65hr。

6.如權利要求5所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，所述種子培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為：可溶性淀粉9.5～10.5，蛋白胨5.5～6.5，酵母提取物5.5～6.5，酸水解酪1.0～2.0，其余為水。

7.如權利要求2所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，所述發酵培養條件是：100L的發酵罐內裝50～70L經滅菌的發酵培養基，發酵溫度26～30℃，通氣量0.5v/min，攪拌速度230～270rmp，發酵3～6d。

8.如權利要求7所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，所述發酵培養基組成，重量(g)/體積(L)比，為：葡萄糖35～45，甘油9～11，黃豆餅9～11，酵母提取物5.0～7.0，蛋白胨，L-Lysine0.1～0.2，K₂HPO₄4.0～6.0，KH₂PO₄?4.0～6.0，NaCl?4.0～6.0，MgSO₄?1.5～2.5，FeSO₄?1.0～2.0，其余為水。

9.如權利要求3所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，雷帕霉素的分離步驟如下：

往所述含雷帕霉素的發酵液中加入0.1％硅藻土，進入壓濾機過濾，收集濾液，得到濕菌絲體濾餅，再往濕菌絲體濾餅中攪拌加入1倍體積的甲醇在50℃水浴中提取兩次，每次150min，分離出提取溶液，合并提取液和提取溶液，用2倍體積的氯仿對提取液和提取溶液的合并液進行萃取，得到氯仿萃取液，萃取液經真空濃縮后，得到濃縮液；

在1kg所述濃縮液中加入4L甲基叔丁基醚萃取濃縮液，有少量結晶吸出，收集結晶并用500ml甲基叔丁基醚洗滌干燥，得到雷帕霉素晶體；

先用2000ml冷卻到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液，再用2份500ml冷卻到0-5℃、0.1mol/L的HCl溶液依次洗滌上述所得雷帕霉素晶體，最后用水洗滌上述所得雷帕霉素晶體至呈中性，濃縮所得液體，濃縮液中加入300ml二異丙基醚后濃縮液中有結晶析出，收集結晶固體，用二異丙基醚洗滌后干燥，得到雷帕霉素粗品。

10.如權利要求3所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，雷帕霉素的提純是指將上述所得雷帕霉素粗品溶解后上硅膠柱進行層析純化，用丙酮的己烷溶液(丙酮30％)進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液進行濃縮后加入雷帕霉素晶體作為種子，將濃縮液冷卻至0-5℃，攪拌1小時后靜置結晶，重結晶獲得的雷帕霉素產品過濾后干燥獲得雷帕霉素終產品。

11.如權利要求1所述的微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，所述吸水鏈霉菌Streptomyces?hygroscopicus，CGMCC?No.5145，為鏈霉菌屬的吸水鏈霉菌S.hygroseopics?NRRL?5491經過菌體培養、預處理、酶解、紫外誘變得到的。