[發明專利]一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110355780.8
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102526721A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 徐進;曾令兵;范玉頂;周勇;肖藝
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: A61K39/15
• 分類號: A61K39/15;C12N7/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，其特征在于：斑點叉尾鮰呼腸孤病毒CCRV-730株，CCTCC?NO：V201133。

2.權利要求1所述的一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，其特征在于：所述的滅活疫苗含有斑點叉尾鮰腎臟細胞系(channel?catfish?kidney，CCK)，CCTCCNO：C201198。

3.權利要求1所述的一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是：

A.CCK細胞培養：取液氮中保存的CCK細胞，37℃溫育2～3分鐘融化，加入含10％V/V小牛血清的MEM培養液：5ml/T₂₅培養瓶，pH7～7.5，轉移至培養瓶中25～30℃培養，靜置6～8小時，待細胞貼壁后換新鮮培養液，在細胞培養2～3天，鋪滿培養瓶底后，采用0.1％～0.5％W/V的胰蛋白酶消化貼壁細胞，進行傳代培養；

B.CCRV-730病毒培養與收獲：待CCK傳代細胞在瓶底鋪滿時，去掉培養液，然后按1/5的培養基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數MOI為1～5PFU/cell，在病毒吸附細胞40～60分鐘后，補加含2％V/V小牛血清的MEM：pH7～7.5維持液進行病毒增殖，在病毒感染48～72小時，收獲病毒，-80℃至室溫凍融3次，3000rpm，4℃，離心10分鐘，取上清再5000rpm，4℃，離心30分鐘以去除游離的細胞碎片，上清為純化的CCRV-730病毒液，CCRV-730病毒液置于-80℃保存備用；

C.病毒滴度測定：將待測病毒液進行10倍稀釋10^-1～10^-10，在96孔板上感染CCK細胞，在病毒感染48～72小時，按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID₅₀，病毒滴度即為滅活疫苗的效價；

D.CCRV-730病毒的滅活：取保存于-80℃的CCRV-730純化病毒液于4℃融化，按0.025％V/V的濃度加入保存于-20℃的滅活劑β丙內酯，混勻后放置于4℃對病毒進行滅活，滅活24h后，將滅活的病毒液置于37℃水浴鍋中孵育2小時以水解β丙內酯；

E、將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水稀釋至效價為10⁵TCID₅₀/ml，得到直接使用的斑點叉尾鮰細胞培養滅活疫苗。

4.權利要求1所述的一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗在治療或預防斑點叉尾鮰出血病藥物中的應用。