[發明專利]含有α-氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌

有效

• 申請號: 201110355694.7
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102653726A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 葉麗娟;王輅;李端華;趙晨;褚以文;潘佳林
• 申請（專利權）人: 中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P35/04;C12R1/19
• 代理公司: 成都立信專利事務所有限公司 51100
• 代理人: 馮忠亮

[0001]?技術領域：

本發明涉及α-氨基酸酯水解酶，更具體地說是涉及黃單胞菌Xanthomonas?rubrilineans菌株的α-氨基酸酯水解酶（α-amino?acid?ester?hydrolase,?AEH）基因的全序列及其所編碼的酶蛋白，目的基因aeh基因克隆在大腸桿菌中的穩定表達。

背景技術：

1972年，Takahashi等人在尋找能合成側鏈有氨基的β-內酰胺抗生素的過程中，發現某些細菌能夠通過α-氨基酸酯酰化7-aminocephem類母核合成非天然的頭孢類抗生素。而負責該反應的酶由于底物范圍限于帶α-氨基的酰基供體，而且相對酰胺，該酶和酯的親和性更高的原因被命名為α-氨基酸酯水解酶。α-氨基酸酯水解酶有諸多優點：由于和酰胺的親和力低，底物水解少；不受苯甘氨酸的抑制；對D型苯甘氨酸甲酯有構象選擇性，工業上可以直接使用消旋混合物，而不必先進行拆分；其最適反應pH比青霉素酰化酶低，也使反應體系中的底物和產物更穩定。長期以來，對α-氨基酸酯水解酶的研究受到生物學家和藥學家的重視，有關α-氨基酸酯水解酶產酶菌株的分離、酶基因的鑒定及其在生物轉化中的應用也有不少報道。Polderman-Tijmes等人通過定點突變確定了混濁醋酸桿菌（Acetobacter?turbidans）產α-氨基酸酯水解酶的活性中心氨基酸位點(J.Biological?Chemistry?vol277,No32:28474,2002)。Barends等人描述了柑橘黃單胞菌（Xanthomonas?citri）中α-氨基酸酯水解酶的基因序列，及1.9埃分辨率的酶晶體結構（J.Biological?Chemistry?vol278，No25:23076，2003）。

在使用Xanthomonas?rubrilineans菌株所產α-氨基酸酯水解酶合成頭孢氨芐、頭孢丙烯、頭孢曲嗪和頭孢唑啉的過程中發現，在所制備無細胞裂解液中含有頭孢菌素酶，而該酶對β-內酰胺環具有極強的水解活力。雖然可以通過進一步純化細胞裂解液特異性地去除頭孢菌素酶，但由于生產成本和產品質量，純化不是理想的措施。?

發明內容：

本發明的目的是構建一個轉化體的重組載體中導入的α-氨基酸酯水解酶基因片斷可以使大腸桿菌表達宿主制備的無細胞裂解液沒有原宿主黃單孢菌株對β—內酰胺環的明顯的破壞作用，可應用于合成頭孢類抗生素藥物的含有α-氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌。

縮寫列表?

7—ADCA：7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸

PGM：D-苯甘氨酸甲酯

7—ACCA：7-氨基-3氯-頭孢烷酸

7—ACA：7-氨基頭孢烷酸

7—APRA：7-氨基-3-丙烯基頭孢烷酸

7—TACA：7-氨基-3-(1,2,3-三唑-5-硫)甲基-頭孢烷酸

本發明是這樣實現的：

本發明含有α—氨基酸酯水解酶基因的大腸桿菌，其特征在于是由大腸桿菌攜帶導入的含-—氨基酸酯水解酶基因片斷aeh作為目的基因的重組質粒pET28a—aeh構成，大腸桿菌的脫氧核糖核酸的堿基序列見序列表中序列1，導入的目的基因的氨基酸序列見序列表中序列2。

制備方法如下：?

（1）提取黃單孢菌基因組，

（2）將黃單孢菌基因組用PCR方法擴增目的基因aeh，所用載體為pGEM-T，aeh的酶切位點為EcoRI和XhoI，將EcoRI-aeh-XhoI片段與載體pGEM-T連接，轉化入宿主菌JM109，選擇白色菌落，得重組質粒pGEM-T-aeh，

（3）將重組質粒pGEM-T-aeh和載體pET28a雙酶切，對線性化后的pET28a載體進行去磷酸化，用連接酶將aeh和載體pET28a連接，轉化入宿主菌JM109，得重組質粒pET28a-aeh，

（4）從宿主菌JM109中提取重組質粒pET28a-aeh轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，

（5）培養轉化細胞，使重組質粒pET28a—aeh隨大腸桿菌BL21（DE3）細胞一起大量擴增，

（6）從擴增的細胞中篩選出含有重組質粒的pET28a-aeh細胞，即得大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-aeh。