[發明專利]一種適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201110355135.6
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102392047A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 倪健;梁輝
• 申請（專利權）人: 蘇州工業園區晨健抗體組藥物開發有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體，所述載體包括以下5’-3’方向的連接元件：

(1)開放閱讀框1：包含依次排列的巨細胞病毒早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子序列；

(2)開放閱讀框2：包含依次排列的巨細胞病毒早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒SV40啟動子序列；

(3)篩選標記基因、猿猴病毒SV40終止子序列。

2.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1和開放閱讀框2的巨細胞病毒早期啟動子/增強子及內含子序列為SEQ?ID?NO：1。

3.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1的牛生長激素轉錄終止子序列為SEQ?ID?NO：2。

4.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框2的牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒SV40啟動子序列為SEQ?ID?NO：3。

5.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述猿猴病毒SV40終止子序列為SEQ?ID?NO：4。

6.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1的多克隆位點包括NheI酶切位點和MluI酶切位點；所述開放閱讀框2的多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點。

7.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述篩選標記基因選自二氫葉酸還原酶基因。

8.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體是由質粒Pcmob3H改造獲得。

9.如權利要求8所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體是在質粒Pcmob3H多克隆位點的SalI酶切位點和NheI酶切位點之間，自5’-3’方向插入所述開放閱讀框1、開放閱讀框2、篩選標記基因以及猿猴病毒SV40終止子序列。

10.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。

11.如權利要求10所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述中國倉鼠卵巢細胞選自CHO-K1或CHO-dhfr^-細胞株。

12.如權利要求1-11任一權利要求所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體在哺乳動物細胞表達蛋白中的應用。

13.如權利要求12所述的應用，其特征在于，所述蛋白為抗體，包括一條重鏈和一條輕鏈。

14.如權利要求13所述的應用，其特征在于，所述抗體為全人TNFα單克隆抗體，包括全人TNFα單克隆抗體的輕鏈和全人TNFα單克隆抗體的重鏈。

15.如權利要求14所述的應用，其特征在于，所述全人TNFα單克隆抗體的輕鏈的DNA序列為SEQ?ID?NO：5，全人TNFα單克隆抗體的重鏈的DNA序列為SEQ?ID?NO：6。

16.一種裝載有全人TNFα單克隆抗體基因的雙順反子表達載體，所述載體為在權利要求1-11任一權利要求所述雙順反子表達載體的基礎上構建，其中，所述開放閱讀框1的多克隆位點插入有全人TNα單克隆抗體輕鏈DNA序列，所述開放閱讀框2的多克隆位點插入有全人TNFα單克隆抗體重鏈DNA序列。

17.如權利要求16所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述全人TNFα單克隆抗體的輕鏈DNA序列為SEQ?ID?NO：5，全人TNFα單克隆抗體的重鏈DNA序列為SEQ?ID?NO：6。

18.如權利要求16所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1的多克隆位點包括NheI酶切位點和MluI酶切位點，所述全人TNFα單克隆抗體輕鏈DNA序列插入于NheI酶切位點和MluI酶切位點之間；所述開放閱讀框2的多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，所述全人TNFα單克隆抗體重鏈DNA序列插入于EcoRI酶切位點和NotI酶切位點之間。