[發明專利]一種金黃色葡萄球菌菌株PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110353530.0
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102399876A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 何華東;姚雪
• 申請（專利權）人: 泰普生物科學（中國）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;G01N21/64
• 代理公司: 福州市鼓樓區博深專利代理事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌菌株PCR檢測試劑盒。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus，SA，簡稱金葡)是醫學上重要的致病菌，其分布廣泛，感染類型多樣，耐藥率高，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(meticillin?resistant?staphylococcus?aureus，MRSA)的感染呈多重耐藥，病死率較高，已成為臨床抗感染治療的難點。

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至嚴重到敗血癥、膿毒癥等全身感染。

目前臨床應用的金黃色葡萄球菌的檢測方法有：常規涂片鏡檢法、培養法、免疫學測定、儀器自動化分析鑒定系統等方法，但是這些方法都存在一定的缺陷：

常規涂片鏡檢是是最基本的細菌學檢查方法，但是敏感性低，特異性差；

培養法是目前臨床上發現傳染源的主要途徑和手段，是金黃色葡萄球菌診斷和治療方案的重要依據，目前仍然以培養法為“金標準”，但是非常耗時，不能實現快速的目的；

免疫學測定方法對培養基的含鹽量有很高的要求，若含鹽量比較高，那么蛋白的合成會受到抑制，而出現假陰性；另外，粗糙型的葡萄球菌和酵母菌偶爾也可引起非特異反應，同時某些含有血漿蛋白結合因子的鏈球菌和其它個別菌類(例如腸桿菌屬的部分菌群)可以非特異地使乳膠顆粒凝集，而出現假陽性。

儀器自動化分析鑒定系統，近年來，相關的革蘭氏陽性球菌快速鑒定系統不斷面市，如Biolog微生物自動分析系統、API?20C、ATB?32C、VITEK?YBC和API?Candid系統等，但這些快速鑒定系統大多數是應用于臨床革蘭氏陽性球菌的鑒定。

常規PCR法雖然有簡便、快速、靈敏，的優勢，但是又不能精確定量和PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題。

發明內容

本發明目的是采用聚合酶鏈式反應及分子信標熒光探針技術對金黃色葡萄球菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷金黃色葡萄球菌的存在，對金黃色葡萄球菌感染的輔助診斷。

本發明的技術方案為提供一種金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒，包括PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括引物和熒光探針，所述引物分為上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

優選的，所述試劑盒還包括tap酶、UNG酶、陽性對照、陰性對照。

優選的，所述試劑盒引入了一個人工構建的neo內參照系統用于避免檢測結果假陰性，所述內參照系統包括上游引物核苷酸序列：SEQ?ID?NO.4；下游引物核苷酸序列：SEQ?ID?NO.5；探針核苷酸序列：SEQ?ID?NO.6。

優選的，所述熒光探針的5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ淬滅基團。

本發明的有益效果為利用金黃色葡萄球菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷金黃色葡萄球菌的存在。本試劑盒具有靈敏度和特異性高、穩定、及時、操作方便等優點。使用了大腸桿菌新霉素基因作為內參照基因，它在金黃色葡萄球菌基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。

附圖說明

圖1：金黃色葡萄球菌nuc基因靈敏度檢測結果圖；

圖2：金黃色葡萄球菌nuc基因特異性結果圖。

具體實施方式

本發明采用聚合酶鏈式反應(PCR)及分子信標熒光探針(MoleculA.r?beacon)技術對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus，SA，簡稱金葡)基因中高保守特異性核酸序列(nuc基因)進行擴增檢測，從而判斷金黃色葡萄球菌的存在。

從而指導臨床醫生對金黃色葡萄球菌感染的病人用藥，幫助預后判斷。

目的基因nuc的檢測：因為nuc基因是金黃色葡萄球菌特有的耐熱核酸酶基因，所以對nuc基因的檢測可以區分金黃色葡萄球菌(SA)和凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)的。

所述nuc基因序列如SEQ?ID?NO.7所示。