[發明專利]利用微生物測定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法

在審

• 申請號: 201110353386.0
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102505038A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 馬秋剛;趙麗紅;計成;董爽
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及一種測定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，具體地說，涉及一種利用微生物測定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法。

背景技術

目前維生素預混料中煙酸及煙酰胺的測定方法主要為高效液相色譜法，盡管該方法具有快速簡便的優點，但該法僅適用于純度高且多為游離狀態的樣品，比如維生素預混料。但對動物全價料及天然飼料原料煙酸及煙酰胺的測定仍然沒有合適的方法，這是因為全價料及天然飼料原料中煙酸含量極低，采用高效液相色譜法測定時出峰面積小或樣品峰與雜峰粘連，誤差很大。

微生物植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)對煙酸及煙酰胺具有極高的特異性與靈敏性，缺乏煙酸與煙酰胺時其生長受到抑制，故利用植物乳桿菌的這一特性可以測定樣品中煙酸和煙酰胺的有效含量。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用微生物測定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，以克服采用高效液相色譜法測定動物全價料及天然飼料原料中煙酸和煙酰胺含量所存在的不足。

為了實現本發明目的，本發明的一種利用微生物測定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，其是將植物乳桿菌接種于含有除煙酸和煙酰胺外的植物乳桿菌生長所用的培養基中，則植物乳桿菌的生長量與所加入的煙酸和煙酰胺標準品的含量相對應，并繪制標準曲線；然后對飼料樣品進行水解處理，制備待測樣品溶液，將等量的植物乳桿菌接種于含有待測樣品溶液的培養基中，從而根據植物乳桿菌的生長量定量計算出飼料樣品中煙酸和煙酰胺的含量。

具體地，前述方法包括以下步驟：1)煙酸和煙酰胺標準溶液的配制：精確稱取煙酸標準品，用乙醇配制成已知濃度的溶液，向含有除煙酸和煙酰胺外的植物乳桿菌生長所用的培養基中加入該煙酸的乙醇溶液，配制成煙酸終濃度為0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45和50ng/mL的標準溶液；2)煙酸和煙酰胺標準曲線的繪制：將定量的植物乳桿菌分別接種于上述不同煙酸濃度的標準溶液中，根據植物乳桿菌的生長量與煙酸標準品的含量繪制標準曲線；3)飼料樣品的水解處理：將飼料樣品溶解于1mol/L硫酸溶液中，超聲后滅菌，用NaOH調節pH值6.0-6.5，然后用鹽酸調節pH值4.5，將水解液轉移至容量瓶中定容，得到待測樣品溶液；4)飼料樣品中煙酸和煙酰胺含量的測定：將等量的植物乳桿菌接種于含有待測樣品溶液的培養基中，根據植物乳桿菌的生長量定量計算出飼料樣品中煙酸和煙酰胺的含量。

本發明的微生物測定法中所用的微生物為植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)ATCC?8014，接種所用的植物乳桿菌為菌液形式，其制備過程如下：1)菌種的活化：將植物乳桿菌ATCC?8014凍干粉加入盛有MRS肉湯培養基的厭氧管中，置于37±1℃培養箱中培養，首次培養48h，以后每24h傳代一次，傳代10次后用穿刺法轉接于MRS瓊脂培養基中，-20℃保存，每周轉接一次；2)菌液的制備：將轉接于MRS肉湯培養基中的菌液倒入10mL離心管中，2000rpm離心10min，棄去上清液，加入10mL?0.9％生理鹽水，震蕩混勻如前離心，反復兩次，再加入10mL生理鹽水制成菌懸液，以生理鹽水為對照，用分光光度計于550nm波長下測定其透光率，透光率為60～80％的菌液為接種時可以使用的菌液。

前述方法中使用的MRS肉湯培養基為：葡萄糖30g、胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、檸檬酸銨2g、醋酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.3g、四水硫酸錳0.12g、吐溫80?1mL和水1000mL，pH6.7±0.2；MRS瓊脂培養基為：向上述MRS肉湯培養基中按1.5％～1.8％的重量比添加瓊脂。

采用上述微生物測定法可對天然飼料及動物全價料中煙酸和煙酰胺的含量進行測定，所述動物全價料為雞、鴨、豬、牛、羊全價料。

微生物測定法的原理是當培養基中含有除煙酸及煙酰胺外的所有菌體生長所需的營養物質時，則在一定范圍內植物乳桿菌的生長量就與標準管中標準溶液的煙酸含量以及未知濃度的待測溶液中煙酸和煙酰胺的有效含量相對應，從而可定量計算出樣品中煙酸及煙酰胺的含量。

本發明提供微生物法對天然飼料原料及動物全價料中煙酸及煙酰胺的含量進行測定，并對其精密度和準確度進行分析，結果證明利用該法測定飼料中煙酸和煙酰胺含量，重現性好，靈敏性高，準確性高，為飼料中煙酸及煙酰胺含量的測定提供參考。

附圖說明

圖1為本發明植物乳桿菌的生長量與煙酸含量的標準曲線。

具體實施方式