[發明專利]兩片段連接法進行HBV全基因組克隆的方法

無效

• 申請號: 201110353382.2
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102559657A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 徐東平;劉研;許智慧;王耀;李曉東;鐘彥偉;戴久增;王琳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/93
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域：

本發明涉及一種采用兩片段連接法進行乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法。

背景技術：

從患者血清中擴增并克隆HBV全基因組序列，將有助于體外實驗評價抗病毒藥物或免疫壓力下低病毒含量的HBV復制力、基因突變特征和頻率及體外感染力，對于監控抗病毒療效及深入闡明HBV生物學活性具有重要意義。

以往對于患者血清中低病毒含量HBV全基因組研究大多限于某一基因片段的研究，通過PCR擴增個體內HBV基因群中的某些亞基因片段，然后直接測序，可在模板量較低的條件下得到亞基因片段擴增產物，但由于HBV基因內部有調控基因，基因片段間又相互重疊，很可能形成HBV不同基因群片段構成一個可供分析的HBV基因片段，使出現在單個基因分子上的突變復雜性及致病和傳播的關系無法精確和全面分析。有研究發現，由于病毒體內存在不同變異株，這種直接測部分序列的方法不能準確地提示完整病毒基因結構與病因及傳播的關系。

采取普通的PCR方法擴增兩個片段，對于低病毒含量HBV?DNA的擴增效果并不理想，特異性不強，且其采用兩次克隆步驟，增加了實驗的復雜程度和成本預算。因此，建立一種靈敏度高、特異性強、簡單方便的低病毒含量HBV全基因組克隆的方法，很有必要。

發明內容：

本發明的目的是提供一種可對低病毒含量血清樣本中的HBV進行全基因組克隆的有效方法。

本發明的技術方案是：

一種采用兩片段連接法進行HBV全基因組克隆的方法，先將HBV?DNA進行巢式PCR反應，然后分別對擴增出的HBV核心區至S區(即CS區)和前S區至X區(即pSX區)兩個片段進行酶切，并將兩個酶切片段連接，以此連接產物為模板用PCR方法擴增該全基因組后進行克隆；其特征為：

所述CS區為HBV基因組的nt?1821～nt?272，pSX區為nt?3194～nt?1825；且進行巢式PCR反應時所用特異性引物的序列如下：

SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：3是CS區的外引物序列；

SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：4是pSX區的外引物序列；

SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：7是CS區的內引物序列；

SEQ?ID?NO：6和SEQ?ID?NO：8是pSX的內引物序列。

調整巢式PCR時的內外引物的濃度，可提高反應的靈敏度，使其能夠進行一管式巢式PCR擴增。最佳的引物濃度為：外引物終濃度為10nmol/L；內引物終濃度為200nmol/L。

所述酶切，是擴增兩個片段后，將產物純化后分別使用內切酶進行酶切；內切酶優選使用XbaI。

所述連接，是使用連接酶進行，優選使用T4DNA連接酶。

本方法還可采用以下一種或幾種手段進行優化，可使發明效果更好或達到最佳：

在引物SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：8序列中加入BspQ?I酶切位點，擴增全長以后便于從載體上獲得完全不含外源序列的HBV全長基因組。

若在PCR反應體系中以1∶10混合加入Pfu?DNA聚合酶和普通Taq?DNA聚合酶，既能提高擴增的特異性，又可顯著降低成本。便于在實驗室開展。

所述用PCR方法擴增出兩個片段時，采用一管式巢式PCR技術，可減少污染，提高產量；且只需經過一次克隆，簡化了操作步驟。

本發明的有益效果是：

1、可對血清樣本中低含量的HBV進行全基因組克隆，擴增的HBV基因組具有生物學活性；

2、不僅可獲得全長HBV?DNA，在體外還檢測到較強的病毒復制力(見實施例2)；

3、操作方法簡便可行。

附圖說明：

圖1是HBV?DNA?CS區的擴增結果1666bp；

圖2是HBV?DNA?pSX區的擴增結果1846bp；

圖3是兩片段連接后HBV全基因組擴增結果3215bp；

具體實施方式：

以下所用的主要實驗材料來源如下：

Pfu和Taq?DNA聚合酶及病毒DNA提取試劑盒：為北京天恩澤基因科技有限公司產品。內切酶Xba?I，T4?DNA連接酶：為NEB公司產品。

實施例1?HBV全基因組克隆