[發(fā)明專利]一種殺蟲Bt蛋白Cry8Kb1、其編碼基因及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110352079.0
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102363632A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設計）人: 朱軍;李平;鄭愛萍;梁紅霞;王世全;鄧其明;李雙成;王玲霞;劉懷年
• 申請（專利權）人: 四川農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C07K14/325
• 分類號: C07K14/325;C12N15/32;C12N15/63;C12N5/10;A01N63/02;A01P7/04;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種新的Bt蛋白及其編碼 基因和應用。

背景技術

在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康 的重要因素，據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟 損失高達14％，病害損失達12％，草害損失達11％。損失額高達1260 億美元，相當于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。農(nóng)業(yè)類害 蟲主要集中在鱗翅目與同翅目之中，鞘翅目金龜甲總科內(nèi)部分昆蟲， 如蠐螬，也是重要的世界性分布地下害蟲，危害雙子葉和單子葉糧 食作物、多種蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下 的種子及幼苗，并且為害期長，從播種到收獲均能為害，造成缺苗 斷壟，甚至絕收，還會影響品質(zhì)。大量調(diào)查表明，蠐螬在地下害蟲 中為害居首位，占總地下害蟲量的70-80％上。主要有暗黑鰓金龜 (Holotrichia?parallela?Motschulsky)、華北大黑鰓金龜(Holotrichia? oblita?faldermann)、銅綠麗金龜(Anomala?carpulenta?Motsch)等， 在我國華北地區(qū)如河北、山東等地危害較為嚴重。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏 陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲 活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal? crystal?proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，該蛋白對 敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt 已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt 還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、 螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害 蟲的防治中Bt已成為化學合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗 蟲工程植物重要的基因來源。

自1981年Schnepf從菌株HD-1Dipel中克隆了第一個能表達殺 蟲活性的基因以來，人們已經(jīng)分離克隆了470多種ICPs的基因，根 據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類 和亞類(Crickmore?N.，et?al.1998.Microbiol?Mol?Biol? Rev，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。 迄今發(fā)現(xiàn)的對蠐螬具有殺蟲活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry18、 cry23、cry37、cry43等類基因(Shu?C.，et?al.2009.Current? Microbiology，58(4)：389-392.)，其中研究最多的是cry8類基因，cry8 類基因由1160-1210個氨基酸組成，分子量為128-137kDa，對金龜 子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有特異的殺蟲活性 (Crickmore?N.，et?al.1998.Microbiol?Mol?Biol?Rev，62：807-813)。 1992年，Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具 有特異殺蟲活性的新菌株(Bt.subsp.japonensis?BuiBui)(Ohba?M.， et?al.1992.Letters?in?Applied?Microbiology，14：54-57)，1994年從中克 隆了一種新的殺蟲基因cry8Ca(Sato?R.，et?al.1994.Curr.Microbiol.28： 15-19)。美國Mycogen公司從Bt菌株PS50C分離的Cry8Aa1和 Cry8Ba1對花金龜Cotinis?sp有明顯的殺蟲活性(US?Patent? 5554534)。美國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bb1和cry8Bc1基 因，發(fā)現(xiàn)對馬鈴薯甲蟲，西方玉米根葉甲，南方玉米根葉甲具有顯 著的殺蟲效果并已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的開發(fā)(Abad，et?al.2002. WO?02/34774?A2)。在我國，河北省農(nóng)科院植保所和河北農(nóng)業(yè)大學近 年先后篩選獲得多株對黃褐麗金龜(A.exoleta)和銅綠麗金龜(A. corpulenta)的幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株，室內(nèi)生測死亡率 均達100％(馮書亮等.一株對金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的蘇云金 桿菌新分離株.中國生物防治，2000，16(2)：74-78)。2004年中國農(nóng) 業(yè)科學院植物保護所Bt185分離了一株對暗黑鰓金龜幼蟲高效 (LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并從中克隆了四個種新的cry8 類基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前絕大部分此類殺 蟲基因均被國外科研究機構或種子公司進行了專利保護；因此，對 這些Bt資源進行挖掘和開發(fā)是一項緊迫而又有價值的工作，擁有自 主知識產(chǎn)權，對于基因克隆、工程菌構建和抗蟲轉(zhuǎn)基因植物均具有重 要的理論意義和應用價值。