[發(fā)明專利]一種殺蟲Bt蛋白Cry8Qa1、其編碼基因及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110352074.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN102363631A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭愛萍;李平;唐裕杰;朱軍;王世全;鄧其明;李雙成;王玲霞;劉懷年
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/325
• 分類號(hào): C07K14/325;C12N15/32;C12N15/63;C12N5/10;A01N47/44;A01P7/04;C12N15/82;A01H5/00;C12R1/07
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的殺蟲Bt蛋白及其 編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康 的重要因素，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟(jì) 損失高達(dá)14％，病害損失達(dá)12％，草害損失達(dá)11％。損失額高達(dá)1260 億美元，相當(dāng)于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。農(nóng)業(yè)類害 蟲主要集中在鱗翅目與同翅目之中，鞘翅目金龜甲總科內(nèi)部分昆蟲， 如蠐螬，也是重要的世界性分布地下害蟲，危害雙子葉和單子葉糧 食作物、多種蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下 的種子及幼苗，并且為害期長，從播種到收獲均能為害，造成缺苗 斷壟，甚至絕收，還會(huì)影響品質(zhì)。大量調(diào)查表明，蠐螬在地下害蟲 中為害居首位，占總地下害蟲量的70-80％上。主要有暗黑鰓金龜 (Holotrichia?parallela?Motschulsky)、華北大黑鰓金龜(Holotrichia? oblita?faldermann)、銅綠麗金龜(Anomala?carpulenta?Motsch)等， 在我國華北地區(qū)如河北、山東等地危害較為嚴(yán)重。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一種革蘭 氏陽性細(xì)菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時(shí)可形成具有殺 蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal? crystal?proteins，簡(jiǎn)稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，該蛋白對(duì) 敏感昆蟲有強(qiáng)烈毒性，而對(duì)高等動(dòng)物和人無毒性。近幾十年來，Bt 已廣泛應(yīng)用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt 還對(duì)膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、 螨類、原生動(dòng)物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害 蟲的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗 蟲工程植物重要的基因來源。

自1981年Schnepf從菌株HD-1Dipel中克隆了第一個(gè)能表達(dá)殺 蟲活性的基因以來，人們已經(jīng)分離克隆了470多種ICPs的基因，根 據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類 和亞類(Crickmore?N.，et?al.Microbiol?Mol?Biol? Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore /Bt/)。迄今發(fā)現(xiàn)的對(duì)蠐螬具有殺蟲活性的Bt基因主要有cry3、cry8、 cry18、cry23、cry37、cry43等類基因(Shu?C.，et?al.2009.Current? Microbiology，58(4)：389-392.)，其中研究最多的是cry8類基因，cry8 類基因由1160-1210個(gè)氨基酸組成，分子量為128-137kDa，對(duì)金龜 子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有特異的殺蟲活性 (Crickmore?N.，et?al.1998.Microbiol?Mol?Biol?Rev，62：807-813)。 1992年，Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對(duì)金龜子幼蟲具 有特異殺蟲活性的新菌株(Bt.subsp.japonensis?BuiBui)(Ohba?M?et? al.，1992.Letters?in?Applied?Microbiology，14：54-57)，1994年從中克 隆了一種新的殺蟲基因cry8Ca(Sato?R.，et?al.1994.Curr.Microbiol.28： 15-19)。美國Mycogen公司從Bt菌株P(guān)S50C分離的Cry8Aa1和 Cry8Ba1對(duì)花金龜Cotinis?sp有明顯的殺蟲活性(US?Patent? 5554534)。美國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bb1和cry8Bc1基 因，發(fā)現(xiàn)對(duì)馬鈴薯甲蟲，西方玉米根葉甲，南方玉米根葉甲具有顯 著的殺蟲效果并已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的開發(fā)(Abad，et?al.2002. WO?02/34774?A2)。在我國，河北省農(nóng)科院植保所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)近 年先后篩選獲得多株對(duì)黃褐麗金龜(A.exoleta)和銅綠麗金龜(A. corpulenta)的幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株，室內(nèi)生測(cè)死亡率 均達(dá)100％(馮書亮等.2000.一株對(duì)金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的 蘇云金桿菌新分離株.中國生物防治，16(2)：74-78)。2004年中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所Bt185分離了一株對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲高效 (LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并從中克隆了四個(gè)種新的cry8 類基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前絕大部分此類殺 蟲基因均被國外科研究機(jī)構(gòu)或種子公司進(jìn)行了專利保護(hù)；因此，對(duì) 這些Bt資源進(jìn)行挖掘和開發(fā)是一項(xiàng)緊迫而又有價(jià)值的工作，擁有自 主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，對(duì)于基因克隆、工程菌構(gòu)建和抗蟲轉(zhuǎn)基因植物均具有重 要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。