[發(fā)明專利]一種啟動子及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110351551.9
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102373207A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹月青;焦?jié)?/a>;夏玉先
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N1/15;C12N15/10;C12N15/66;C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種啟動子，包括含有此啟動子的結(jié)構(gòu)和載體，并涉及此啟動子的制備方法。

背景技術(shù)

昆蟲病原絲狀真菌可通過侵染昆蟲使其致死，因此，已作為防治昆蟲的有效的生物農(nóng)藥。但野生昆蟲病原真菌毒力低，致死昆蟲時間長。通過基因工程的手段，超表達某些外源或內(nèi)源毒力基因，可以大大提高病原真菌毒力。但目前昆蟲病原真菌中常用的啟動基因表達的啟動子大都是來自其他動植物病原真菌，目前應(yīng)用最廣泛的是構(gòu)巢曲霉三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(PgpdA)，是多種真菌中外源及內(nèi)源基因的組成性表達首選的啟動子，如人類病原真菌，植物病原真菌及昆蟲病原真菌。但是PgpdA的啟動效率表現(xiàn)不盡人意。而且，PgpdA長2.2kb，片段較大，不利于基因工程中載體構(gòu)建。尋找真菌內(nèi)源的高效率的組成型啟動子，一方面可為昆蟲病原真菌基因工程研究提供工具，同時也為利用該啟動子構(gòu)建具有高效殺蟲活性的昆蟲病原真菌奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種啟動效率高，易構(gòu)建的啟動子，即PMagpd啟動子。

本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述啟動子的表達載體。

本發(fā)明的再一目的在于提供含有上述啟動子的轉(zhuǎn)化載體。

本發(fā)明的再一目的在于提供含有上述啟動子的宿主或宿主細胞。

本發(fā)明的目的是通過如下措施實現(xiàn)的：

一種啟動子，為SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列或為對SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列進行一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ?IDNO：1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列。

一種啟動子，為能在高度嚴格條件下與SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或為能在高度嚴格條件下與對SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列進行一個或多個核酸的取代、缺失或添加所獲得的，具有與SEQ?ID?NO：1相同的作為啟動子能力的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

上述啟動子，包括表1所述的DNA序列，在所述啟動子的位置如表1所述。表1中所示DNA序列是PMagpd啟動子中的一些保守序列和反向或正向重復序列，這些序列一般來說是不可取代或缺失，它們的組合發(fā)揮著啟動效力。

表1

注：大寫字母為正向重復，小寫字母為反向重復

優(yōu)選地，上述啟動子來源于蝗綠僵菌。更優(yōu)選地，上述啟動子來源于蝗綠僵菌的Magpd基因上游序列。

進一步地，發(fā)明人運用基因工程手段將該啟動子制成構(gòu)建體，表達載體，轉(zhuǎn)化載體以利于啟動子的后續(xù)應(yīng)用。

一種構(gòu)建體，含有上述啟動子。

一種表達載體，含有上述啟動子或構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述表達載體為pK2-PMagpd-GUS，其物理圖譜如圖2所示。

一種轉(zhuǎn)化載體，含有上述啟動子、構(gòu)建體或表達載體。

一種轉(zhuǎn)化過的宿主或宿主細胞，含有上述啟動子、構(gòu)建體、表達載體或轉(zhuǎn)化載體。

優(yōu)選地，上述宿主或宿主細胞是真菌或真菌細胞。更優(yōu)選地，上述宿主或宿主細胞是昆蟲病原絲狀真菌。更優(yōu)選地，上述宿主或宿主細胞是綠僵菌或白僵菌。最優(yōu)選地，上述宿主或宿主細胞是蝗綠僵菌。

另外，本發(fā)明提供了上述啟動子的制備方法，包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)蝗綠僵菌(Metarzhizium?acridum)菌株CQMa102。

(2)從菌株中提取基因組DNA。

(3)用序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3的引物從基因組DNA中擴增所述啟動子序列。

優(yōu)選地，上述啟動子的制備方法包括如下步驟：

將蝗綠僵菌(Metarzhizium?acridum)菌株，在1/4SDAY液體培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母浸膏5.0g/L，pH值調(diào)至6.0)，28℃250rpm振蕩培養(yǎng)3天，用真菌基因DNA提取試劑盒提取基因組DNA。根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列(Genbank登錄號ANDI00000000)，獲取了Magpd基因組序列(Genbank登錄號EFY84384.1)，用引物MgpdF和MgpdR，其序列見SEQ?ID?NO.2和SEQID?NO.3所示，擴增Magpd基因上游的所述啟動子序列。

本發(fā)明還提供了所述啟動子的轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將PMagpd啟動子與目的基因可操作地連接；