[發明專利]固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法

有效

• 申請號: 201110350198.2
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102507833A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 韓超;劉翠平;劉濱;陳祥準;朱振甌
• 申請（專利權）人: 韓超
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司 33211
• 代理人: 李友福

1.一種固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

①超聲萃取：稱取牛奶1.7～2.3g，加入0.8～1.5mL¹³C標記的香蘭素和0.8～1.5mL?5,6,7,8-D4標記的香豆素，所述¹³C標記的香蘭素的濃度為500μg/L，所述5,6,7,8-D4標記的香豆素的濃度為500μg/L，再加入17～23mL的甲醇/水混合溶液，在27～33℃下超聲處理25～35min，超聲頻率為36～38kHz，取出靜置，取上層清液，定容，得到待凈化液；

②固相萃取凈化：取VARIAN?BOND?ELUT?PLEXA?C₁₈SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4～6mL待凈化液至SPE柱，再依次用4～6mL水和4～6mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱，，將SPE柱真空抽干，用8～12mL的甲醇/水混合溶液對SPE柱進行洗脫，得到洗脫液，將洗脫液過微孔濾膜，備用；

③標準溶液的配置：取香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、¹³C標記的香蘭素和5,6,7,8-D4標記的香豆素，用甲醇/水混合溶液分別配制成質量濃度為100mg/L的單標儲備液，進行測定使用時，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇與水的比例為1:1，稀釋上述標準儲備液，將香蘭素、乙基香蘭素、香豆素分別配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50μg/L的混合標準工作溶液，同時將¹³C標記的香蘭素和5,6,7,8-D4標記的香豆素配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，10μg/L的混合標準工作溶液；

④測定：將過0.45μm微孔濾膜厚的洗脫液進入LC-MS/MS，采用多反應監測(MRM)模式檢測，內標法定量。

2.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于：所述的步驟①中的加入的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為1:1。

3.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于：所述的步驟②中的淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為2:8，洗脫所用的甲醇/水混合溶液中甲醇與水的體積比為1:1。

4.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于：所述的步驟②中微孔濾膜為0.45μm微孔濾膜。

5.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于：所述的LC-MS/MS的色譜條件如下：

色譜柱：Waters?XBridge^TM?C₁₈反相柱，色譜柱規格為2.1×150?mm，3.5?μm；

流速：300μL/min；

流動相：A為0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈，A與B的體積比為：55:45；

等度洗脫時間：5min；

進樣量：5μL；

色譜柱溫度：25～35℃。

6.根據權利要求1所述的固相萃取-液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定牛奶中香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的方法，其特征在于：所述的LC-MS/MS的質譜條件如下：

電噴霧離子源：正離子掃描，電噴霧電壓為5000V；

離子源溫度：540～560℃；

霧化氣壓力為47～53psi；

輔助氣流速為38～42?psi；

氣簾氣壓力為9～11?psi；

碰撞氣壓力為18～22?psi。