[發(fā)明專利]一種用于生產(chǎn)新型微生物源殺菌劑的生物工程菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110347790.7
• 申請日: 2011-11-07
• 公開（公告）號: CN102399737A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許煜泉;申慧峰;何亞文;周萬平
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/78;C12P17/12;A01N43/60;A01P3/00;C12R1/38
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物源農(nóng)藥生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于生產(chǎn)新型微生物源殺菌劑的生物工程菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

農(nóng)作物病害引起的損失幅度約占總產(chǎn)量的25～75％，以我國主要的糧食作物水稻為例，每年種植面積約4億畝，按畝產(chǎn)量400公斤，水稻病害平均引起減產(chǎn)10％計，每年造成經(jīng)濟損失達300多億元人民幣之巨，嚴重威脅糧食作物的安全生產(chǎn)。目前，生產(chǎn)上控制植物病害除了選用良種和改進栽培措施外，主要依靠噴灑化學殺菌劑。目前使用的大多化學殺菌劑對人體和動物具有不同程度的毒害作用，殘留在植物可食部分的有害成份會對人體健康造成潛在威脅，已經(jīng)引起政府和社會各階層的關(guān)注；不僅如此，有些化學農(nóng)藥難以分解，會長期地累積在生態(tài)系統(tǒng)中，造成對環(huán)境的污染，不利于社會經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展；而且，現(xiàn)有的化學農(nóng)藥對某些植物病害并不完全有效。因此，在努力發(fā)展新一代化學農(nóng)藥的同時，還需要大力研究和發(fā)展高效、安全、經(jīng)濟、對環(huán)境相容性好的生物源農(nóng)藥。目前，在生產(chǎn)上已經(jīng)推廣使用的生物源農(nóng)藥，其種類和數(shù)量都較少，有些品種則由于使用年久，引起了植物病原菌的抗藥性，防治效果不夠理想。以水稻紋枯病為例，防治該病害的藥劑主要依賴于老牌生物源農(nóng)藥井崗霉素。但是，經(jīng)過將近40年的長期使用，部分水稻紋枯病菌的融合群已產(chǎn)生抗藥性；而且，井崗霉素僅對水稻紋枯病菌有效，對其他病原菌沒有明顯的防治效果，使用范圍具有很大的局限性。

生物農(nóng)藥促生拈抗菌M18，對植物病害具有高效、安全、廣譜的殺菌作用，與環(huán)境相容性好，易于在環(huán)境中解體。該促生拈抗菌M18已于2000年6月27日在中國專利局指定的保藏單位：北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNO.0462。生物農(nóng)藥促生拈抗菌M18的制備和應(yīng)用，已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利，專利號為00119857.2。但是，生物農(nóng)藥促生拈抗菌M18是一種活菌菌劑，其作用機理主要是通過M18活菌合成抗植物病害的活性成分實現(xiàn)對農(nóng)作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌體本身的代謝調(diào)控機制和環(huán)境條件的影響。因而，對植物病害的防治效果具有不穩(wěn)定性的缺陷，難以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中進行大規(guī)模的推廣應(yīng)用。

已經(jīng)查明，促生拈抗菌M18防治植物病害的主要活性成分是吩嗪-1-羧酸，從促生拈抗菌M18的發(fā)酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌對農(nóng)作物病害的防治同樣具有高效、安全、廣譜、與環(huán)境相容性好等特征；同時，能克服利用促生拈抗菌M18防治病害效果不穩(wěn)定性的缺陷。但是，利用促生拈抗菌M18發(fā)酵，合成活性成分吩嗪-1-羧酸的效價很低，僅為每升200毫克左右，如何提高發(fā)酵效價，降低使用成本，成為開發(fā)本產(chǎn)品的瓶頸所在。近年來，我們已經(jīng)運用分子生物學的技術(shù)，對促生拈抗菌M18合成吩嗪-1-羧酸的調(diào)控機制，開展深入地研究。在此基礎(chǔ)上，運用基因工程手段，對促生拈抗菌M18基因組中的雙組分調(diào)控基因gacA開展了定向失活突變，獲得了M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量，使其發(fā)酵效價達到每升1500-1700毫克左右。該研究成果的技術(shù)方法已經(jīng)于2004年在《微生物學報》44卷第761～765頁公開，論文題目為《假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調(diào)控》。在2006年，名稱為“利用促生拈抗菌M18衍生菌株制備殺菌劑的方法”的中國發(fā)明專利中(專利號：ZL200610023459.9)，提供一種了利用促生拈抗菌M18衍生菌株M18G和M18R制備殺菌劑的方法，利用微生物的代謝產(chǎn)物而非微生物活體制備殺菌劑，通過兩種衍生菌株的代謝產(chǎn)物的復配，達到提高防治效果的目的。2009年，我們又發(fā)明了利用工程菌株M18G攜帶質(zhì)粒pME6032Phz生產(chǎn)吩嗪-1-羧酸的方法，能使吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵效價達到每升5700～6600毫克的水平，進一步降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模推廣應(yīng)用。該項技術(shù)已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利，專利號：ZL200910198664.2。以吩嗪-1-羧酸為主要成分的微生物源殺菌劑，我國農(nóng)藥命名單位已經(jīng)定名為申嗪霉素。申嗪霉素原藥和1％申嗪霉素懸浮劑于2011年獲得了農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的正式登記證(登記號：PB20110314和PB20110315)。農(nóng)業(yè)部已經(jīng)將申嗪霉素列入“十二五”期間全國推廣產(chǎn)品(證書號：TG2011-002)。

但是，吩嗪-1-羧酸對病源菌的防病作用與使用時的酸度(pH)值密切相關(guān)，在pH值7.0的條件下，其抗菌活性僅為pH值5.0條件下的20％，大大降低了吩嗪-1-羧酸在堿性條件下的防病效果。同時發(fā)現(xiàn)，促生拈抗菌M18及其衍生菌株M18G的基因組中，phzH基因是一個已經(jīng)發(fā)生突變的失活基因。