[發(fā)明專(zhuān)利]一種高效提取綿羊皮膚組織蛋白的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110345434.1
• 申請(qǐng)日: 2011-11-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103087146A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雪梅;李文蓉;賀三剛;張寧;劉明軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C07K1/14
• 分類(lèi)號(hào): C07K1/14;G01N33/53
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯(lián)專(zhuān)利代理事務(wù)所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及綿羊皮膚組織蛋白提取的方法，可用于蛋白的Western?blot雜交檢測(cè)，也可用于二維凝膠電泳(2-DE)分離，以及利用皮膚組織制備生物活性的蛋白質(zhì)。?

背景技術(shù)

綿羊皮膚組織致密，結(jié)構(gòu)完善，有著重要的保護(hù)作用。綿羊皮膚由表皮和真皮組成，表皮有許多衍生物，如各種腺體、毛、角、爪、甲、蹄；真皮發(fā)達(dá)，由膠原纖維及彈性纖維的結(jié)締組織構(gòu)成，兩種纖維交錯(cuò)排列，其間分布有各種結(jié)締組織細(xì)胞、感受器官、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢及血管、淋巴等；相對(duì)于其它組織來(lái)說(shuō)，綿羊皮膚組織結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，皮膚組織蛋白的提取也較其它組織難度大；獲得一種高效提取綿羊皮膚組織蛋白的方法對(duì)于研究綿羊組織器官功能、生物活性蛋白制備具有重要意義。?

據(jù)文獻(xiàn)檢索披露：①2010年徐小燕、夏蒲，邢亞楠等在《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2010,39(5):336-339.?發(fā)表的文章?“凍結(jié)破碎法提取組織蛋白方法初探”揭示了凍結(jié)破碎法和勻漿法提取小鼠組織蛋白后進(jìn)行蛋白定量，然后用Western?blot檢測(cè)內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明兩種方法提取的總蛋白濃度以及β-actin蛋白表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②2009年王簕、裴國(guó)獻(xiàn)等在《生命科學(xué)研究》2009,13（2）:137-141）發(fā)表的“兔骨組織總蛋白的提取和在免疫印跡法中的應(yīng)用”采用單純研磨法、單純錘擊法和錘擊研磨法分別對(duì)兔骨組織蛋白進(jìn)行提取，通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡法檢測(cè)骨組織中β-actin的表達(dá)，比較3種骨組織蛋白提取法，結(jié)果表明錘擊研磨法更為方便、快捷，可作為提取骨組織蛋白的一種理想方法。③2007年王桂葉等在《鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）》.2007,42(4):660-662.上發(fā)明的“3種方法提取胸腺組織蛋白雙向電泳純化結(jié)果比較”分別采用組織裂解液法、丙酮沉淀法和蛋白純化試劑3種方法提取7例重癥肌無(wú)力患者胸腺組織蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE和二維電泳檢測(cè)蛋白。結(jié)果表明：采用蛋白純化試劑法提取胸腺組織蛋白，能夠獲得較好2-DE凝膠圖像。檢索未見(jiàn)有理想的提取皮膚組織蛋白的方法報(bào)道。?

本發(fā)明構(gòu)思是將冷凍破碎與冰浴超聲相結(jié)合，針對(duì)綿羊皮膚組織的特點(diǎn)，在進(jìn)行皮膚的研磨和蛋白質(zhì)溶解時(shí)，先盡量拔除綿羊皮膚表皮密布的毛發(fā)(毛發(fā)含有大量的角蛋白)，使角蛋白及非皮膚組織的蛋白質(zhì)的含量大大降低，從而增加了表皮及真皮組織的蛋白質(zhì)在溶解液中的相對(duì)濃度，有效富集了皮膚組織蛋白，為研究皮膚中蛋白質(zhì)表達(dá)譜和制備皮膚組織的活性蛋白奠定了基礎(chǔ)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于：提供高效提取綿羊皮膚組織蛋白的方法?，為制備綿羊皮膚組織蛋白和進(jìn)一步研究綿羊皮膚組織蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。?

本發(fā)明目是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種高效提取綿羊皮膚組織蛋白的方法，分前處理、冷凍破碎、冰浴超聲、蛋白定量及SDS-PAGE、Western-blot的檢測(cè)步驟：?

步驟1.將冰浴皮膚組織樣品拔毛處理，用預(yù)冷的1×PBS洗滌3次，吸干液體；稱(chēng)取25-30mg樣品，置于預(yù)冷的2ml離心管中，將其剪碎至0.8-1mm³的小塊，置于-70℃冰箱中；

步驟2.取上步樣品，加入直徑為5-7cm無(wú)菌鋼珠，置于TissueLyser??LT儀器中粉碎，其頻率50Hz，工作2-5min；破碎后，取出鋼珠，加入預(yù)冷的蛋白酶抑制劑的裂解液，其加量為每100mg濕重組織加200-300μl，置于冰浴中超聲破碎，其功率200W，工作10S，間隙15S,25次，且避免大量泡沫產(chǎn)生；?

步驟3.將超聲后的樣品置于漩渦混合器上渦旋30-40S，4℃、采用13000轉(zhuǎn)/分鐘、離心25-30分鐘；提取上清液，置于-70℃冰箱中，用BCA法測(cè)定其蛋白濃度；取100μg蛋白樣品加入等量的2×loading?buffer混合均勻，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；

步驟4.采用Western?blotting免疫印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá)，即操作：將凝膠放入電轉(zhuǎn)緩沖液中，濕轉(zhuǎn)法100V轉(zhuǎn)印60?min后，加入5％脫脂奶粉室溫封閉2?h，用一抗鼠抗HA單抗1∶400稀釋?zhuān)瑫r(shí)以β-actin抗體1:400稀釋作內(nèi)參，4℃過(guò)夜孵育，用PBST洗滌5次，每次10?min，用二抗為IRDye??800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體1∶12?000稀釋?zhuān)覝胤跤?0?min，用PBST洗滌5次，每次10?min，再用PBS洗滌一次，用Li-Cor?Biosciences掃描成像；