[發明專利]中華按蚊抗藥性TaqMan PCR檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201110344452.8
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102373281A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 趙彤言;譚偉龍;李春曉;董言德;汪中明;郭曉霞;劉美德;張映梅;邢丹
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種中華按蚊抗藥性TaqMan?PCR檢測試劑盒及其應用。?

背景技術

中華按蚊(Anopheles?sinensis)分布于我國除青海和新疆以外的所有省市，是我國平原水網和水稻種植地區的優勢蚊種，家野兩棲，白天多棲息在村莊四周的作物植棵和蘆葦叢、灌木叢中，部分棲息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、馬、豬等大牲畜為主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中華按蚊是我國瘧疾的重要傳播媒介，尤其在北緯34°以北的地區，它是主要的或唯一的傳播媒介。目前，瘧疾尚無有效疫苗可用，控制瘧疾媒介的種群數量是防治瘧疾的重要手段。化學防治因其易操作，能夠迅速、有效地控制害蟲種群，在媒介昆蟲防制規劃中占有重要地位。過去幾十年來，針對中華按蚊的生活習性，用擬除蟲菊酯類殺蟲劑，采用滯留噴灑和浸泡蚊帳等滅蚊防瘧措施，取得了顯著效果。然而，化學防治在充分發揮其優勢的同時，也帶來了負面效果，導致了中華按蚊抗藥性的產生。九十年代以來，國內各地報道的中華按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性越來越明顯。1993年重慶中華按蚊對溴氰菊酯和DDT達到初級抗性，1998年在云南采集的10個中華按蚊種群有5個對DDT產生抗性，1999年浙江溫州、寧波等地的中華按蚊種群達到高抗種群(R/S＝15-20)，2009年，江蘇部分地區的中華按蚊對溴氰菊酯產生了高度抗性。?

害蟲對殺蟲劑產生抗性以后，化學防治的效果就會隨著抗藥性的升高而下降，害蟲的防治也會受到嚴重的影響。為了應對害蟲種群的抗性，為了克服抗性達到預期的防治效果，殺蟲劑的使用量，包括單位面積的施藥量和施藥次數，就不得不持續增加，這無異于在持續增加殺蟲劑對媒介昆蟲抗性的選擇壓力，而且這種抗藥性還可向遠距離擴散，間接地還可能造成某些媒介疾病的發生與流行。從這些年對害蟲抗藥性的監測來看，抗藥性增長的速度遠大于新農藥、新劑型研發的速度。因此，如何加強媒介昆蟲的抗藥性治理、延緩抗藥性的產生和發展、延長現有殺蟲劑的使用壽命是害蟲治理中的重要內容。?

昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性主要是擊倒抗性(knockdown?resistance，kdr)，kdr基因在中華按蚊對擬除蟲菊酯的抗性中具有重要作用。擬除蟲菊酯的作用靶標主要是昆蟲電壓依賴性神經細胞膜上的鈉離子通道，離子通道上的作用靶點對殺蟲劑降低了敏感性而產生擊倒抗性，因此擊倒抗性不同于代謝抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制劑所降低。通過比較敏感、抗性中華按蚊的部分鈉通道序列，發現para?型鈉通道基因中的kdr的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG→TTT的突變及L1014C(亮氨酸到半胱氨酸)即TTG-TGT的突變和擊倒抗性相關。這是我國關于中華按蚊擊倒抗性及其基因突變的首次報道。?

kdr基因可以作為昆蟲對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態。譚偉龍等(2011)用特異性等位基因PCR方法，對采江蘇、安徽的11個中華按蚊種群進行致死中濃度(LC50)和kdr基因頻率的測定，并且發現LC₅₀為代表的高效氯氰菊酯抗性與中華按蚊kdr等位基因頻率之間存在正相關關系。研究說明Kdr基因可以作為中華按蚊對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態，可以預測抗性的發生和發展。?

目前我國還沒有成型的針對中華按蚊的kdr抗性分子檢測方法和試劑盒。?

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的專用引物。?

本發明提供的專用引物，由引物1和引物2組成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。?

所述突變位點為L1014F或L1014C。?

本發明的另一個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的試劑。?

本發明提供的試劑，由試劑1和試劑2組成，?

所述試劑1由所述專用引物、探針2和探針3組成；?

所述試劑1由所述專用引物、探針1和探針3組成；?

所述探針1的核苷酸序列為序列表中的序列3；?

所述探針2的核苷酸序列為序列表中的序列4；?

所述探針3的核苷酸序列為序列表中的序列5；?

所述探針1、探針2和探針3的3’末端均標記MGB基團；?

所述探針1和探針2的5’末端均標記FAM基團；?