[發明專利]一種檢測魚類致病菌的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201110343826.4
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102382881A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 黃冠軍;劉天強;劉衍鵬;李茂
• 申請（專利權）人: 通威股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/31;C12N15/10;C12R1/01
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽

技術領域

本發明涉及一種檢測魚類致病菌的試劑盒，屬于生物技術領域。

背景技術

鮰愛德華氏菌(Edwardsiella?ictaluri)于1979年首次作為斑點叉尾鮰(Ictalurus?punctatus)養殖的一種新的致病菌被報道，近年從斑點叉尾鮰病魚診斷分離得到的細菌85％是鮰愛德華氏菌。

檢測鮰愛德華氏菌的傳統方法是細菌的常規分離鑒定，但所需時間長，程序繁瑣，準確度較低。近年來，用PCR檢測診斷的疾病的方法正在興起。梁萬文，“斑點叉尾鮰敗血癥PCR診斷方法的建立”，大連水產學院學報，2007年8月第22卷第4期公開了一種用PCR方法檢測斑點叉尾鮰敗血癥的方法，但該方法的檢測靶標是一種有待驗證的基因(Edwardsiella?ictaluri?putative?protein，eip)，其是否為致病性基因也有待進一步探討，不具有代表性，且該文獻檢測對象為廣西研究所魚病研究室從叉尾鮰上分離鑒定并保存的，不是標準菌株，不能說明該文獻的方法能準確檢測鮰愛德華氏菌。

亟需尋找一種能準確檢測鮰愛德華氏菌的方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種新的試劑盒。

本發明提供了一種檢測魚類致病菌的試劑盒，所述的試劑盒包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～2所示的引物，用以擴增鮰愛德華氏菌的基因。

本發明還提供一種檢測魚類致病菌的方法，它包括如下步驟：

(1)提取待檢樣本的基因組DNA；

(2)以前述基因組DNA為模板，用SEQ?ID?NO.1～2所示的引物擴增；

(3)對擴增結果進行檢測。

所述步驟(1)中待檢樣本為魚體或者養殖水體。

所述魚體為肌肉、肝臟、鰓或者脾臟。

本發明最后提供了SEQ?ID?NO.1～2所示的核苷酸序列在擴增或者檢測來自鮰愛德華氏菌的基因的用途。

本發明提供的檢測試劑盒和檢測方法特異性強、靈敏度高，可以快速準確地判斷魚體或者水體是否被鮰愛德華氏菌污染，為斑點叉尾鮰的養殖提供保障。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1鮰愛德華氏菌常規PCR引物驗證實驗結果。1：DNA；2：單菌落；3：空白對照；M：DNA?maker?I，該maker有6條條帶，從上至下分子量依次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp。

圖2鮰愛德華氏菌PCR檢測體系的特異性檢測結果。1：空白對照；2：熒光假單胞菌；3：河水弧菌；4：嗜水氣單胞菌；5：豚鼠氣單胞菌；6：溫和氣單胞菌；7：柱狀黃桿菌；8：鮰愛德華氏菌；M：DNA?marker?I。

圖3鮰愛德華氏菌PCR檢測體系的靈敏度檢測結果。1-8：梯度稀釋的DNA模板，濃度依次為25ng/μL-2.5fg/μL；9：空白對照；M：DNA?maker?I。

圖4鮰愛德華氏菌PCR檢測體系的靈敏度檢測結果。1-8：梯度稀釋的菌液，濃度依次為0.28×10⁸cfu/mL-0.28×10¹cfu/mL；9：空白對照；M：DNAmaker?I。

圖5斑點叉尾鮰病原檢測結果。M：DNA?maker?I；1：肌肉組織；2：肌肉組織；3：肝組織；4：肌肉組織；5：肌肉組織；6：肌肉組織；7：肌肉組織；8：肌肉組織；9：肌肉組織；10：空白對照；11：魚鰓；12：魚鰓；13：脾；14：血液；15：陽性對照。

具體實施方式

實驗材料：

實驗菌株：柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌，均購自中國科學院水生生物研究所，鮰愛德華氏菌ATCC33202，購自ATCC。