[發明專利]基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法

有效

• 申請號: 201110343795.2
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102358910A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 曾新;何農躍;柳明
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于：1)?制備適合于獲取核酸序列拷貝數信息的磁性介質；2)?設計能與目標核酸序列特異性結合的引物與探針，探針5’端的修飾對應1)所述磁性介質上所修飾之功能化基團，之后以產物捕獲方式獲取目標核酸片段的拷貝數信息，產物捕獲方式指先進行引物延伸反應，再利用磁性介質表面連接的特異性探針與延伸反應產物之間的堿基互補配對捕獲延伸得到的核酸片段；3)?根據引物設計數據確定Tm值，根據Tm值確定退火溫度，加入雜交緩沖溶液，經過變性與退火過程，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結合；4)?加入延伸反應緩沖溶液，進行一個循環后結束反應，再加入已制備的連接有特異性探針的磁性介質與延伸產物進行雜交反應，從而捕獲目標核酸片段至磁性介質；5)?磁分離，對磁性介質進行清洗，即得到獲取了待測模板中目標核酸片段拷貝數信息的磁性介質；6)?對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測，比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。

2.根據權利要求1所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述磁性介質為體現磁學性質的物體。

3.根據權利要求2所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述體現磁學性質的物體為具有磁學性質的物質構成的物體或以具有磁學性質的物質為部件的物體。

4.根據權利要求1所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述延伸反應體系為常規使用的PCR緩沖體系，所使用的酶為普通的Taq?DNA聚合酶、Vent^-?DNA聚合酶或DeepVent^-?DNA聚合酶。

5.一種基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于制備步驟為：

a.磁性顆粒制備，采用溶劑熱法制備直徑在300?nm的四氧化三鐵磁性顆粒：稱取1.35?g的FeCl₃·6H₂O、3.6?g的醋酸鈉以及1.0?g聚乙二醇溶解于40?mL乙二醇中，磁力攪拌溶解，形成黃褐色膠體；將膠體轉移至四氟乙烯反應釜，密封，置于200℃烘箱中反應8小時；反應完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得Fe₃O₄磁性顆粒；用100mL?0.1mol?鹽酸浸泡Fe₃O₄磁性顆粒1小時，超聲分散30分鐘；再重新分散于體積濃度80%的乙醇中，以25℃、280?轉/分攪拌，同時加入200?μL正硅酸乙酯，反應1小時；以乙醇、去離子水交叉洗滌；將顆粒重新分散于100?mL乙醇中，加入1.0?g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25℃、300轉/分條件下攪拌，同時加入1?mL?正硅酸乙酯，反應3小時后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次，最后以乙醇分散，于4℃保存；制備得到核-殼結構的Fe₃O₄SiO₂復合顆粒；磁性納米顆粒的氨基化，將上述制得的Fe₃O₄SiO₂復合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10?μL?APTS滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7小時，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應介質中分離出來，用乙醇溶液對其清洗5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺清洗5次，最后以5?mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；氨基化磁性納米顆粒的羧基化，取分散于DMF溶液中的氨基化SiO₂/Fe₃O₄磁性納米顆粒，濃度為5?mg/mL，逐滴加入到等體積丁二酸酐濃度為0.001M的DMF溶液中，室溫下反應24小時，用水洗滌數次后磁分離，加入雙蒸水定容至10?mg/mL；即得到功能性的羧基化磁珠；將上述羧基化磁珠用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液反復清洗，磁分離，加入100?μM以MES溶液稀釋的氨基化探針至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下旋轉孵育30?分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺至磁珠中混合均勻，再以MES溶液補足體積至50?μL，在4℃條件下旋轉孵育2小時，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于50?mM，pH?7.4?Tris溶液中孵育15分鐘以中和沒有反應的活化的羧基基團，再以50?mM，含0.1?%wt?Tween-20的Tris清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液封閉磁珠；即得到了連接有特異性探針的功能化磁珠；

b.設計一對能與GAPDH、GSTT1與GSTM1基因特異性結合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾，通過氨基-羧基相互反應將探針固定至磁性顆粒表面；

c.延伸：加入10×Buffer?2?μL、25?mM??Mg²⁺?2μL、2.5?mM??dNTP?1.5?μL、上下游引物各2.5?μL，DNA模板2.5?μL、DNA聚合酶0.5?μL，加去離子水補足體積至20?μL，將反應混合物置于PCR儀中；PCR參數：94℃?5分鐘；95℃?30秒，54℃?30秒，72℃?1分鐘，1個循環；將得到的雙鏈延伸產物進行變性，通過堿基互補配對原則將變性后的單鏈延伸產物與連有特異性探針的磁性顆粒雜交，然后將連有單鏈DNA的磁性顆粒磁分離，進行清洗；從而得到反映了目標基因拷貝數信息的磁性介質；

d.對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測，比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。